一株养殖场乌鸡源H7N9流感HA基因的序列分析
摘要：H7N9流感的宿主主要是鸡，本研究对1株养殖场乌鸡源H7N9流感HA基因的序列进行测定，分析其分子特征，发现该毒株与当地流行的毒株核苷酸相似性较高，达98.7%,说明本次养殖场的乌鸡感染事件由本地区流行毒株引起。该病毒HA蛋白潜在的糖基化位点与其他参考毒株一致，均为5个，分别位于30～32、46～48、249～251、421～423、493～495位氨基酸。裂解位点为PEIPKG/RGLF，呈弱毒的分子特征。受体结合位点中，235位Q（H3编码226位），仍保持禽源与α-2,3受体结合的特征，但195位（H3编码186位）与169（H3编码160位）位均出现了适应人与α-2,6Gal受体结合的特征。本文为H7N9病毒感染不同宿主后的分子特征的研究提供有益的补充。
关键词：H7N9 乌鸡 HA 序列分析
H7N9流感自2013年在华东地区出现已来, 已在多个省市流行，并造成了1000余人的感染，严重危害公共卫生安全和家禽产业的发展。随着H7N9的流行,其宿主范围也在不断扩大，当前已确认的易感禽类有鸡、鸭、鹅、鸽、麻雀和鹌鹑等，为适应不同的宿主，病毒在分子水平上也会相应的发生不同的变异。2016年12月广东某供澳乌鸡（竹丝鸡）场发生了感染，本文旨在通过对该宿主来源病毒HA基因的序列测定与分析，为该病的防控提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品：拭子样品1份，采集于供澳乌鸡场，该场禽群均无临床表现。
1.1.2试剂：抽提试剂RNAiso Reagent、一步法RT-PCR扩增试剂（PrimeScript? One Step RT-PCR Kit ），购自宝生物工程（大连）有限公司。
1.1.3 HA基因的扩增引物：上游引物P1：5`- cgagtgagcaaaagcaggggatacaa-3`；下游引物P2：5`- ccctctccctgtgcattctggtgtct-3`，P3: 5`-aagcagggatacaaaatgaac-3`；下游引物P4：5`- ccctccactatgatagcagtcc-3`，上海立菲生物工程有限公司合成。
1.2 方法
1.2.1 RNA的提取：按抽提试剂操作说明书进行。
1.2.2 HA基因扩增体系与程序：上、下游引物(25μM)各1μL、2×Bμffer 25μL、PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 2μL 、DEPC水11μL和所提取的病毒RNA 10μL，体系共50μL，反应程序为50℃ 30min，95℃ 2min，然后95℃ 30s、53℃ 30s、72℃ 2min，30个循环，72℃延伸8min。
1.2.3 序列测定和分析
将PCR产物送上海立菲生物工程有限公司进行测序，结果用DNAstar软件进行序列拼接。并与下载自GenBank 的11株不同时期的H7N9 亚型禽流感病毒HA基因组序列进行比较, 采用MEGA 5.0软件绘制其HA因组的系统进化树。
2 结果与分析
2.1 HA 基因扩增结果：
扩增出大小分别为901bp和979bp的特异性条带，与设计预期相符，见图1。
图1 PCR扩增结果
M、DNA Marker DL2000；1-2、P1P2扩增结果；3、P3P4扩增结果
2.2 HA基因遗传进化分析
将乌鸡毒株A/silker chicken/GD01/2016序列（已上传Genbank，序列号MG607400）,通过与Genbank上收录的序列进行比较，结果相似性最高的为KP415932(chicken/Dongguan/191/2014)，二者核苷酸的相似性为98.7%，处于同一分支的还有KP418167(silkie chicken/Shantou/2056/2014)，相似性为98.5%。与其他有关参考毒株的相似性较高，介于95.3%～98.5%，其中与早期的参考毒株A/Anhui/2013、KP414851(silkie chicken/Jiangxi/9476/2014)相似性较高，均为98.2%；与另3株市场中检测到的竹丝鸡相似性为95.3%～98.5%毒株，见图2。
图2 H7N9 HA基因的系统进化树
2.3 HA 基因氨基酸序列分析
该株病毒的cDNA均包含了1个完整的开放阅读框架(ORF)，编码区长1683bp，共编码560个氨基酸（aa），包括信号肽(1～16aa)，HA1(19～338aa)，HA2 (340-560aa)和1个精氨酸(339aa)。
2.4 糖基化位点的分析与裂解位点
氨基酸序列分析结果表明，HA基因的潜在糖基化位点分别位于30～32、46～48、249～251、421～423、493～495位aa等5个位点上，位点1～3位于HA1，位点4～5位于HA2。与所有参考毒株均一致。裂解位点方面，毒株A/silkie chicken/GD01/2016与呈现弱毒的分子特征，PEIPKG↓RGLF，与其他毒株一致，详见表1。
2.5 受体结合位点
参照陈国清等分析方法，HA蛋白氨基酸143-147位为VTSAC（右侧壁），169位为A，195位为V，199位为E，233～238位为NGQSGR（左侧壁）。与早期代表株相比，有2个氨基酸位点发生了变化，一个是143A→V，这与人源毒株有差异；另一个是235位Q（H3编码226位），仍保持禽源与α-2,3Gal受体结合的特征，未出现人源毒株为L的突变，但195位（H3编码186位）与169（H3编码160位）位均出现了适应人与α-2,6Gal受体结合的特征，详见表2。
3 讨论：
3.1 由于本毒株与2014年KP415932(chicken/Dongguan/191/2014)HA基因相似性高达98.7%，推测其由当地流行毒株所引起，经乌鸡传播后也未出现明显的变异。
3.2 乌鸡在H7N9传播过程中的作用。我们在日常检测中发现乌鸡较普通鸡更易感，需引起注意。Lam TT等于H7N9流感流行初期（2013～2014年）在汕头、江西、韶兴等地的乌鸡样品中检出大量病毒。推测除了乌鸡在H7N9的传播中可能扮演重要角色。
3.3 受体结合位点适应性变化。唾液酸受体主要有两种，包括含有α-2,3和α-2,6半乳糖苷键的受体。其中α-2,3受体常见于禽类，而人类上呼吸道表面更多见的是α-2,6受体。增强感染的突变位点主要有HA上同时发生Q226L、G186V、T160A突变，其中Q226L、G186V两个同时突变，较只发生1个突变的感染人能力强。此外，HA受体结合区150环发生T160A突变减弱了病毒与α-2,3Gal受体的结合能力，同样导致病毒结合人类受体的能力增加[4]，本毒株G186V、T160A有与人受体结合的变异，但235位Q（H3编码226位），仍保持禽源与α-2,3Gal受体结合的特征，同时143位为V（H3编码132位）发生了变异。这也许是H7N9病毒在养殖场中传播后发生的适应乌鸡的宿主的变化。
3.4 以往报道的低致病力H7N9病毒主要来源于活禽交易市场，养殖场中罕有报道，本文首次对养殖场乌鸡的H7N9病毒HA序列进行分析，为H7N9病毒感染不同宿主后的分子变异特征的研究提供有益的补充。
致谢：样品由江门市动物疫病预防控制中心送检。
来源：《动物防疫一线》2018年第5期
作者：广东省动物疫病预防控制中心 卢受昇，孙彦伟，查云峰，叶健，吴立炀