猪支原体肺炎诊断方法研究进展

核心提示：猪支原体性肺炎是由猪肺炎支原体引发的一种慢性肺炎，又称猪地方流行性肺炎，本病是对养猪业造成重大经济损失最常发生、流行最广最难净化的重要疫病之一。本病虽为老病，但近年来由于经常和PRRS、圆环病毒等其它病原混合感染，造成重大的经济损失而突显出了其重要性。因此，对猪支原体肺炎正确诊断、检测，及早防治非常重要。

猪肺炎支原体(Myeoplasmahyopneumoniae，Mhp)是一种无细胞壁、介于细菌和病毒之间的最简单的能够自行复制的原核生物。Mhp是与猪的下呼吸道纤毛上皮细胞紧密结合的细胞外病原体，而不是通过组织侵入体内。体内感染时，Mhp识别呼吸道黏膜纤毛细胞的特异性受体，并在呼吸道繁殖。一般认为，Mhp与呼吸道黏膜纤毛的特异性黏附是引起支原体肺炎的先决条件。所以，长期以来人们一直在努力试图揭示这种黏附作用的机理。另外由于肺炎支原体能穿透黏膜层与纤毛粘在一起，破坏纤毛的完整性，同时分泌一些有害因子，破坏纤毛的游走性，致使纤毛大量脱落，这为其它细菌和病毒入侵创造了条件，使损失加剧。猪单独感染猪肺炎支原体，猪体重和饲料转化率没有降低，也不影响体内脂肪和蛋白质的增加。短期对猪的生长无明显影响。然而当猪肺炎支原体与其它病原体共同感染时，猪的临床症状加重。

1临床诊断

猪支原体肺炎(Mycoplasmalpneumoniaofswine，MPS)主要临床症状是猪感染后发生慢性干咳、生长受阻、发育迟缓、发病率高、死亡率低以及扩散缓慢，易反复发作。但猪肺炎支原体易与其它病原体如胸膜肺炎放线杆菌、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、肺炎巴氏杆菌等混合感染，造成MPS临床症状复杂化，而且有些感染猪并不出现临床症状，因此，通过临床症状只能怀疑猪息有MPS。

2病理学诊断

进行病理剖检时，发现病变主要在肺脏、肺门淋巴结和纵膈淋巴结，其他组织器官没有特殊病变。特征病变为肺脏膨大，有不同程度的气肿和水肿，双肺的心叶、尖叶、中间叶和部分病例的膈叶前下缘出现对称性融合性支气管肺炎病变，其中以心叶最明显，尖叶和中间叶次之。

3病原检测技术

3．1病原分离培养

能从患病部位分离出肺炎支原体是确诊猪患有MPS的一种特异的方法。但Mhp是最难分离和鉴定的病原体之一，它生长缓慢且经常因猪鼻支原体过度生长而被掩盖，而且药物治疗后或康复的猪也很难再分离出Mhp。虽然通过改进分离用培养基和分离方法从病变部位分离出Mhp的分离率逐渐增高，但在多数情况下，分离培养诊断仍不可行。

3．2免疫荧光技术

1970年L·Eluger等首先报道用荧光技术来检测猪肺中的Mhp，1971年Earlier将Mhp接种到兔肉汤后用直接免疫荧光法进行诊断。随后改良的直接和间接荧光抗体技术也被用于检测肺组织中的Mhp。Amanfu等用改良的直接荧光抗体技术连续检测人工感染猪，结果接种后2～12周在患病猪的细支气管和细支气管上皮检测到Mhp，接种后4～6周荧光最强，8～12周荧光强度逐渐下降。而将间接免疫荧光技术用于冰冻切片的检测，已在丹麦SPF猪群中得到了应用。荧光抗体技术特别适合于Mhp急性期感染，因为这时在肺部存在大量的病原。但当猪在受到抗生素治疗后或转为慢性感染时，血清阳性猪由于支原体的数量不足，用免疫荧光技术检测而易出现假阴性结果。

3．3免疫酶技术

酶联免疫过氧化物和间接免疫过氧化物酶试验用于检测病肺中的Mhp，克服了荧光抗体技术不能有效检测慢性感染猪、需要新鲜冰冻组织和荧光显微镜以及样品不能长期保存的缺点。用ELIP检查肺冰冻切片和支气管的涂片时，支原体被染成淡红褐色的多形态颗粒，反应很稳定。Doster等用福尔马林固定石蜡包埋猪肺，用间接过氧化物酶试验检测Mhp，用光学显微镜就能观察到结构清晰的Mhp，而且样品可长期保存，用于重新评价，比荧光抗体法更敏感。当没有鲜组织或其他特异性试验时可采用此法。

3．4免疫印迹法

免疫印迹(immtmoblot)是以免疫覆盖液为检测探针，对抗原或抗体进行印迹分析的通称。蛋白质印迹中由于引进了血清学检测技术，使结果的分析更加准确、细致。StPkiovstiL(1991)在蛋白质印迹试验中用抗猪肺炎支原体P36蛋白的兔血清检测了13株不同地方的猪肺炎支原体和来自不同实验室的3株标准菌株J，实验结果显示每株菌在36KDa蛋白处有很强的反应。用同样的抗血清，而抗原用47种来自人、老鼠、兔子、家禽、反刍动物、狗和猫的支原体属作蛋白质，实验结果显示这些微生物与P36抗血清无反应。

3．5核酸探针诊断技术

核酸探针技术可解决猪肺炎支原体培养和鉴定难、费时的难题。Stemke将MhpDNA的EcoRl酶切片段随机克隆到Ml3mpl9中，用重组产物作探针来检测Mhp。此方法敏感性高，但特异性不强，易与同源性高的絮状支原体产生交叉反应。Ahrens等将Mhp基因文库中的一个l．3kb的DNA片段用35S标记作为探针通过点杂交检测猪、牛的不同支原体，结果探针仅对Mhp有特异性反应。Futo等建立了用与MhprRNA互补的寡聚脱氧核苷酸作DNA探针，用印标记后检测支气管肺泡洗出液和病肺组织等临诊样品的方法，其特异性和敏感性都大大提高，比用放射同位素测定的灵敏度高10倍。Johansson等设计出与Mhpl6SrRNA可变区互补的特异性寡聚核苷酸探针，用斑点杂交检测来自感染猪的肺活组织或肺其他感染物。Kwon等用PCR扩增的520bp的重复DNA序列作为DNA探针，用地高辛标记探针通过组织原位杂交法检测自然感染了Mhp的病原DNA，这种原位杂交技术能有效检测出来自自然感染猪组织中的Mhp核酸以及病原核酸分布情况。李桂兰(2007)采用地高辛标记的探针对可疑病料组织进行斑点杂交，显示此方法特异性强，灵敏性高。肖国生等(2008)采用在猪肺炎支原体的16SrRNA、P36和P463个基因内设计3个靶基因片段，用PCR标记Cy3探针，建立了用于检测和鉴定猪肺炎支原体的检测芯片方法，该检测芯片能快速检测临床样品混合培养物中的猪肺炎支原体，还能鉴定可疑分离株是猪肺炎支原体还是其它支原体。

3．6 PCR诊断技术

3．6．1普通PCR技术

HaraswaaR等(1991)报道合成针对猪肺炎支原体的引物，可扩增520bP的DNA片段，产物以合成的寡核苷酸探针进行印渍杂交鉴定，证明这种方法具有特异性。ArtiushinS等(1993)根据l6srRNA序列设计PCR引物，通过种特异性寡核苷酸探针进行鉴定，能够扩增出人工感染猪气管分泌液和肺病灶样品中的猪肺炎支原体，并且所建立的PCR方法具有较强的特异性和敏感性。StemkeGW等(1994)建立的PCR可用于猪肺炎支原体的检定与猪鼻肺炎支原体，絮状支原体的鉴别，引物选自16srRNA基因序列，以猪肺炎支原体和絮状支原体DNA扩增，可获得大小为200bp和400bp的产物，而猪鼻支原体未有扩增产物。BlnahcardB等(1996)将PCR的敏感性极限提高到500fg提纯猪肺炎支原体DNA(约4X102菌数)，以此检查试验感染猪气管，支气管冲洗液，结果与免疫荧光对照的符合率达到84．6％(121／143)。SornesneV等(1997)将200头SPF猪感染猪肺炎支原体强毒而使其发病，产生临床症状，证明在猪发生肺炎的急性期，PCR方法具有高度敏感性，优于分离培养，免疫荧光检测和ELISA方法。CaronJ等(2000)通过扩增猪肺炎支原体的P36和P46蛋白基因，可以区分猪肺炎支原体和猪鼻支原体感染。在国内，于敏等(2003)根据国内外发表猪肺炎支原体16srRNA基因设计了一对特异性引物，扩增出一个大小为653bp的特异性片段，敏感性试验显示这对引物能够检测到lng的DNA，结果表明此方法特异且敏感。Zeehf(2005)改进了一种real—timePCR(rtPCR)方法，从活猪鼻拭子中检测猪肺炎支原体检测了730份不同猪场的鼻拭子，结果显示该方法快速、准确，有l00％特异性。StakenborgT等(2006)发明了一种多重PCR方法可以从临床肺组织中快速鉴别肺炎支原体、猪鼻支原体和絮状支原体。同戈(2007)采用SYBRGREEN荧光定量PCR检测技术对Mhp做到了定性，定量的检测。刘茂军等(2008)据猪肺炎支原体的P36基因序列设计一对引物，建立猪肺炎支原体PCR检测方法，此方法可区别猪鼻支原体、絮状支原体和鸡毒支原体，最低检出量为4．26ng。

3．6．2套式PCR技术

Sternke GW等(1997)发展了套式PCR技术，敏感性提高到可检测出—个MhpDNA，并可以直接特异性地检测出肺中的Mhp。StarkKD等(1998)则利用新的套式PCR首次成功地在试验条件和野外条件下检测出空气样品中的Mhp。CalsmiglaiM等(1999)根据猪肺炎支原体的16srDNA设计了两套种特异性套式PCR引物，研究了一组猪鼻拭子标本中的猪肺炎支原体DNA，发现PCR的检测阳性率为3．6％(2／55)，而套式PCR的检测阳性率为54．5％（30／55)，实验得到了预期的结果，且与存在于猪呼吸道的其他种支原体无交叉反应，说明该检测方法对从鼻拭子中检测猪肺炎支原体优于其他PCR法。VedrniE等(2000赧道，应用套式PCR检测猪气管，支气管灌洗液中的猪肺炎支原体DNA较ELISA和IF法更为灵敏。ViccaJ等(2002)调查了临床感染猪肺炎支原体和亚临床感染猪肺炎支原体的猪群，用套式PCR研究鼻拭子中的猪肺炎支原体，发现第6周时阳性猪在临床和亚临床感染猪群中的百分率分别为l6％和0％。同年，KurthKT等(2002)应用套式PCR检测了一些来自试验感染猪肺炎支原体的猪样品，结果表明来自支气管小泡和气管支气管位点的样品是大多数感染猪肺炎支原体的前兆，而鼻拭子和肺组织位点的样品不是实验引发感染的可靠指标。Otgariiy等(2005)发展的套式PCR通过检测鼻拭子可以用于猪支原体肺炎的监测。

4血清学抗体检测技术

目前用于MPS的血清学试验有放射免疫扩散测定、补体结合试验、间接血凝试验、凝集试验以及酶联免疫吸附试验等，其中以间接血凝试验、补体结合试验和酶联免疫吸附试验更为理想。

4．1间接血凝试验

间接血凝试验(IHA)具有一定的特异性和敏感性，是诊断猪支原体肺炎的常用方法之一。Dowdle等首先用IHA检测Mhp抗体，但被感染猪的血清能使绵羊红细胞自然溶血。Lam等用猪红细胞代替绵羊红细胞，虽然其效价比用绵羊红细胞低，但在试验中不易发生溶血现象。由于血清中含有特异吸附因子易溶血，制备的红细胞存在个体差异不易标准化，其试验也不易操作，使得IHA在临床应用中受到了一定的限制。

4．2补体结合试验

补体结合试验(CFT)也是检测猪血清中Mhp抗体的有效试验之一，包括微管补体结合试验和微量修正补体结合试验。补体结合试验在实验接种猪和自然感染猪中，CFT阳性率与猪肺部病变有较好的相关性，但仍存在着很高的假阳性和假阴性。Lloyd等认为，假阴性是由于循环抗原的影响，而假阳性是由于感染了其他支原体出现交叉反应或是因为没产生或发现病变。CFF不能确定4—9周龄猪的感染状况。CFT在敏感性和特异性方面存在一定的局限性，但如果综合运用临诊和病理显微检查，CFT仍是确定Mhp感染状况的有效手段之一。

4．3酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验是目前国内外最常用于诊断Mhp的方法之一，具有能进行定量分析、敏感性高、特异性强的特点。Bmggmann等首次报道以SDS提取物作抗原，用间接ELISA检测Mhp抗体的敏感性高，但易与絮状支原体和猪鼻支原体发生非特异性交叉反应。Nicolet等改用Tween20提取物作抗原，用间接ELISA检测Mhp抗体，结果比用支原体全菌和SDS溶解物作抗原有更高的特异性，但与絮状支原体也存在部分交叉反应。Bereiter等用改进的Tween20ELISA降低了因絮状支原体感染引起的交叉反应。Fut0克隆了Mhp的46ku表面抗原(p46)基因，诱变后在Ecoli中表达，用提纯的重组P46蛋白作抗原用于ELISA诊断，结果发现与其他猪支原体无交叉反应。Feld等建立了一种单克隆抗体阻断ELISA，此法可从单个抗原决定簇上检测Mhp抗体，而且不需完全纯化抗原。随后，Potier等建立了一种用Mhp特有的40ku膜蛋白作抗原的单克隆抗体阻断ELISA，用此法检测接种了猪鼻支原体和絮状支原体的SPF猪和感染Mhp猪的血清，发现Mhp与絮状支原体和猪鼻支原体无交叉反应。EunJin

Jang等(2007)将黏附因子P97在E. coli中表达，使猪肺炎支原体裂解成6个片段，采用其中的50KDa的蛋白做为抗原做ELISA，结果发现特异性很强。在国内，刘茂军等(2007)选用猪肺炎支原体MhpJ株全菌膜蛋白作为包被抗原，建立检测猪肺炎支原体抗体的间接ELISA检测方法，结果显示此方法灵敏度很高。

4．4表面细胞质基因组共振实验

Kim TJ(2006)利用P97粘附因子中的分子量为30KDa的蛋白为抗原建立了检测猪肺炎支原体抗体滴度的表面细胞质基因组共振实验。该实验和传统ELISA方法同时检测了来自6个猪场的70份血清，结果显示表面细胞质基因组共振实验具有很高的特异性和敏感性，而且两种方法有正相关性。

5小结

用于猪支原体肺炎的诊断方法很多，以上是目前国内外报道较多且常用的几种检测技术，每种方法都有各自的优缺点。在临床应用时，除根据试验条件和目的选择合适的检测技术外，还应结合临床症状和病理组织学病变进行综合诊断，以得到准确可靠的诊断结果。