离子交换法纯化阿魏酸的研究

摘要：本研究采用黑曲霉固体发酵法制备的酶制剂降解麦麸，以酶解液为原料，采用D201#大孔树脂对阿魏酸进行分离提纯，探讨了上柱工艺条件和洗脱条件对离子交换的影响，确定最适离子交换操作工艺：室温下，料液阿魏酸浓度在2O0Omg/L～3000mg/L之间，pH值为9．0，上柱流速为l ml／min；洗脱剂配比(v/v)为无水乙醇：水：盐酸=60：36：4，洗脱流速为1 ml／min。在该操作_T-艺条件下，阿魏酸收率达97％以上，且经过薄层层析法验证纯度大大提高。
阿魏酸(4-羟基-3-甲氧基肉桂酸、FA)是植物中普遍存在的一种酚酸，在植物中很少以游离态存在，主要与低聚糖、多胺、脂类和多糖形成结合态，是当归、川芎、阿魏等中药的有效成分之一。它有许多保健功能，如清除自由基、抗血栓、降血脂、防治冠心病、抗菌消炎、抗突变和防癌、增强精子活力等。
目前阿魏酸在医药、食品、化妆品等领域的用途越来越广泛。阿魏酸可以通过合成法和碱解法获得。化学合成法因为反应周期长和产率低，限制了其发展；碱解法是目前商品化生产阿魏酸的主要途径，但所用原料谷维素只占米糠油的1．5％．2．8％，因此产量大大受限；为此采用发酵产酶来制备阿魏酸的研究成为近年来的研究热点。
国外学者在酶法生产阿魏酸方面进行了大量研究。由于阿魏酸在细胞壁多糖结构中的特殊位置，我们采用双酶法(阿魏酸酯酶和阿拉伯木聚糖酶协同作用1降解胞壁多糖，在得到阿魏酸的同时还获得高产量的阿拉伯木聚糖。但是酶解液是一个复杂的混合体系，从中分离出阿魏酸产品比较困难。目前，阿魏酸的提取方法主要是用有机溶剂萃取法。我们依据阿魏酸“酸沉碱溶”、易溶于醇类等有机溶剂的特性，选用阴离子交换树脂对阿魏酸进行提取。离子交换法由于具有产品纯度高，能耗低，提取过程无相变，操作简单，成本低廉等优点，但该方法还存在多种影响因素对交换过程的影响程度较为模糊的缺陷。作者以麦麸酶法降解液为研究对象确定了最佳的离子交换法提取精制工艺。
1 材料和仪器
1．1 材料和试剂
麦麸由南方面粉集团公司提供，高温高压处理后备用。黑曲霉(Aspergillus niger)(ATCC16404)购自广州环凯生化试剂公司，经选育获得，菌种采用PDA马铃薯培养基保藏。淀粉酶、木瓜蛋白酶购自远天酶制剂厂。离予交换树脂：D201#大孔强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂(南开大学化工厂)；717#(201×7)强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂(广州化学试剂二厂)。标准品：反式阿魏酸(trans-Ferulic acid)，上海试剂一厂。其它试剂：浓盐酸，无水乙醇，冰醋酸，柠檬酸
等均为分析纯；薄层层析硅胶GF254(60型1，中国青岛海洋化工集团公司出品f符合HG／T2354—92)。
1．2 仪器设备
20 ITlln／400 FflITI具塞色层分析柱；LXJ-II型离心沉淀机(上海医用分析仪器厂)；DHL-A 电脑恒流泵(上海沪西分析仪器厂)；53WB型紫外一可见分光光度计(上海光学仪器厂)；三用紫外分析仪(上海顾村电光仪器厂)。
2 实验方法
2．1 麦麸酶法降解液制备
2．1．1 麦麸黑曲霉发酵制备混合酶制剂
本实验采用固体发酵法制备混合酶制剂。种子培养基组成为MgSO4、麦麸、水(1：800：1600)，采用三角瓶(500mD32℃培养3d；发酵麸曲组成跟种子培养基相同，以5％的接种量接入种曲，曲盘厚度1—2cm，上盖一层无菌纱布，32℃培养3d；去离子水40℃浸提lh，过滤，离心，上清80％终浓度的(NH4)2SO4盐析，离心后用pH=4．4左右酸化水溶解，得混合酶制剂。
2．1．2 去淀粉麦麸(DSWB)制备
经高温高压灭酶处理后的麦麸，先后经淀粉酶和木瓜蛋白酶处理，脱除淀粉和蛋白质，烘干粉碎备用。
2．1．3 酶解
混合酶制剂中一定比例加入DSWB，40℃酶解6h，然后高温灭酶，离心、过滤、浓缩，得麦麸酶法降解液(上柱料液)。
2．2 树脂的预处理
先用去离子水漂洗，直到排水清晰为止，然后用去离子水浸泡24h，使其充分膨胀。接着用树脂体积2倍量的2-5％HCL浸泡2-4h，并不时搅拌，后用去离子水洗至中性。最后用5-8%NaOH浸泡24小时转型，用去离子水洗至中性后备甩。
2．3 静态交换实验
精确量取经预处理的离子交换树脂lml，分别放入盛有50ml阿魏酸溶液液的250ml锥形瓶中，置于摇床上室温200r／min转速下交换24h，以差减法计算离子交换树脂的平衡交换容量。
2.4 层析柱离子交换工艺
室温条件下，树脂装填量为12ml，树脂高度为60mm。将经过处理的麦麸酶降解液上柱交换，流出液收集为粗阿拉伯木聚糖液，将柱予用水洗至无色后，用洗脱液洗脱。检测流出液、水洗液中阿魏酸含量，并定量收集、测定洗脱液中阿魏酸的含量。
2．5 分析方法
2．5．1 阿魏酸质量浓度的测定：在波长为320nm处采用紫外一分光光度法
2．5．2阿魏酸收率(或简称“收率”)：(洗脱液中阿魏酸量／进样料液中阿魏酸量)x100％
2．5．3 阿魏酸纯度测定一薄层层析法
吸取少量酶解液和离子交换洗脱液，真空干燥后用适量乙醇溶解、配成与阿魏酸标准样浓度相同的样品点样，三样品点在同一张硅胶板上以苯一乙酸乙酯一甲酸(V／V，12：4：1)为展开剂展开、晾干，在254nm紫外分析仪下观察。
3 结果与讨论
3．1 离子交换树脂确定
依据使用树脂性能指标，确定静态吸附所用阿魏酸溶液的浓度为3．75mg／ml，pH为9．0。室温下吸附交换24小时，吸附交换后剩余阿魏酸浓度分别为1．79mg／ml(717#)和2．07mg／ml(D201#)，从而知体积交换吸附容量分别为98．05 mg／ml(717#)和83．66mg／ml(D201#)湿树脂。图1为同等条件下(树脂量：12ml；进样量：100ml：初始阿魏酸浓度：2．42mg／ml；洗脱液：4ml浓盐酸+60ml无水乙醇+36ml水)洗脱的效果比较。图中看出D201#树脂的洗脱效果明显高于717#树脂，且经过计算，D2Ol}}和7 17#两种交换树脂的阿魏酸洗脱收率分别为99．01％和78．08％。因此，综合考虑吸附和洗脱效果，故确定D201#树脂为研究对象。
3．2 层析柱离子交换工艺
3．2．1 上柱料液pH值对离子交换的影响
料液pH值是影响交换平衡的重要因素。阿魏酸的特性是易溶于醇类等强极性溶剂，较难溶于水；酸性条件下会结晶析出，碱性条件溶解性好。因此为减少上柱前阿魏酸的过多损失，选用进样料液为碱性。并参考使用D201#树脂性能指标，确定上柱料液pH值为9．0。
3．2．2 上柱流速对离子交换的影响
为了进行有效的交换，离子交换过程中必须使固液两相有充分的接触时间。如果上柱流速增大，固液接触时间缩短，树脂吸附效果变差；但上柱流速过慢，导致操作时间成本增加。
上柱料液阿魏酸浓度C0为22 12．96mg／1，pH值为9．0时，如表l，考察三种上柱流速的吸附效果，流出液阿魏酸浓度越低则浓度交换比率越大，说明吸附效果越好。实验表明上柱流速为lml／min时吸附效果最好，故确定上柱流速为1ml／min。
3．2．3 上柱料液质量浓度对离子交换的影响
上柱流速一定时，随着上柱阿魏酸质量浓度的增加，树脂的交换吸附饱和点提前。在树脂量足够的情况下，流出液浓度相差不大，交换吸附比率则有较大差别。如表2中，树脂量(12m1)、进样量(100m1)和上柱流速(1ml／min)均相同，实验表明树脂的体积交换比率随上柱料液浓度增加而增加。从而，尽可能的提高上柱料液浓度，有利于提高离子交换效果。但同时考虑到酶降解液浓缩的附加成本，操作中确定上柱浓度在2OOOmg/L3000 mg／L之间最佳。综上所述，确定层析柱离子交换工艺为：麦麸酶降解液真空浓缩到浓度2000mg／L-3000 mg／L之间，调pH值为9．0，室温条件下以流速1 ml／min上柱。3-3 洗脱工艺研究
3．3．1 洗脱剂组成和浓度的确定
离子交换的目的是获得高纯度的阿魏酸，交换吸附之后选择好的洗脱剂进行解吸是整个提取过程中的关键。如表3，树脂量(12m1)、吸附量均相同条件下，尝试六种不同组成的洗脱剂进行洗脱，由表中结果知，4号洗脱剂效果最好几乎是仝部洗脱，另外作为氯型的D201#树脂在预处理时要用到盐酸，选择4号洗脱剂还可节省树脂预处理的成本。实验发现，盐酸在洗脱剂中的不同含量对洗脱效果是有影响的。如表4和图2，考察了三种不同盐酸含量的洗脱剂对阿魏酸的解吸曲线的影响，可以看出洗脱剂B(4mlHCI+60ml无水乙醇+36mlH2O)洗脱效果最好，解吸速度快，且收率最高达到99．0l% ，几乎达到完全洗脱。
3．3．2 洗脱流速对洗脱工艺的影响
洗脱流速直接影响到洗脱液和树脂的交换时间。流速太快，接触时间短，未能充分解吸而增加了洗脱剂用量，从而增加了操作成本和后续浓缩成本；流速太慢，虽然解吸效果好，但操作周期加长，增加了操作时间成本。根据文献报道和预试结果，实验选择l ml／min、结果表明，流速为2．5 ml／min时有较高的初始洗脱浓度，但1 ml／min洗脱流速时总体洗脱效果最好，阿魏酸收率达到97．79％，而流速为2．5 ml／min和5m!\"min时，阿魏酸收率分别为81．74％和58．83％。因此选择1 ml／min洗脱流速比较合适。
综上所述，确定洗脱工艺为：洗脱剂配比为(4ml盐酸)：(60ml无水乙醇)：(36ml水)，以流速lml／min洗脱。
3．4 操作工艺验证
采用已经得到的层析柱离子交换和洗脱工艺对整个离子交换过程进行验证。结果如表5所示。离子交换条件为：D201#树脂，20 mnl／400 mnl具塞色层分析柱，树脂装填量为12ml，树脂高度为60mm，酶解液预处理后用NaOH溶液调pH值为9．0，上柱流速为lml／min。之后用去离子水洗至流出液无色，用洗脱液(无水乙醇：水：盐酸=60：36：4)洗脱，洗脱速度为lml／min，分段收集洗脱液。由表5中结果可知，该离子交换操作工艺可使阿魏酸收率达到97．79％。
3．5 阿魏酸纯度验证
对洗脱液进行真空浓缩回收乙醇后，酸化结晶，然后用适量无水乙醇溶解，用薄层层析法检验其纯度。如图4所示，自上而下三个点分别是浓缩成品、标准品和麦麸酶降解液。酶解液拖尾明显且在阿魏酸前面还有两个明显的点，表明杂质很多；浓缩所得成品看不到拖尾且阿魏酸的前面亦没有其他杂质，表明纯度
4 结论
在酶解液浓缩到浓度2000mg／L-3000mg／L之间时，调pH值为9．O，室温条件下以流速l ml／min上柱；水洗至无色后，加洗脱剂洗脱，洗脱剂配比为HCI：无水乙醇：H20=4：60：36，洗脱速度为l ml／min时，用D201#大孔树脂从酶解液中提取阿魏酸的收率达到97 以上；而且纯度明显提高。