猪链球菌2型感染SPF小型猪模型的构建

摘　要：构建了致病性猪链球菌2型(SS2)感染模型。通过典型临床症状观察、剖检病变和组织学观察及病原分离鉴定，证实该模型能成功模拟自然感染状态下SS2引起的典型临床症状和病理变化特点，稳定性好，可进一步用于致病性SS2在动物体内动态分布规律、致病机制和机体免疫应答以及疫苗的效果评价和相关药物筛选等方面的研究，对于猪链球菌2型感染的防控具有重要意义。

关键词：猪链球菌2型；SPF小型猪；模型

猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype2，SS2)感染后引起的疫病不但给养猪业造成严重的经济损失，也给公共卫生和食品安全带来了威胁，已成为受到全球关注的人兽共患病。国内外针对猪链球菌病进行了大量研究，在鉴别诊断猪链球菌病、猪链球菌2型毒力因子及其疫苗制剂的研究上取得了不少的进展。但迄今为止，由于不同来源猪链球菌2型的致病性复杂多变，同时缺乏标准的猪链球菌2型猪感染模型，对于猪链球菌2型感染的致病机理尚未十分清楚。国内外对于该病致病机制的研究主要采用细胞系培养或猪全血培养等体外试验方法。实验动物大多采用小鼠、豚鼠、兔等。但是这些动物模型有很多局限性，难以稳定的复制出猪链球菌2型感染的典型症状，尤其难以建立脑膜炎症状，给研究带来了很多不确定性。因此，迫切需要构建一种重复性好、能模拟自然感染发病猪临床症状和病理变化的动物模型。SPF小型猪具有易感性强、体型小、操作简单、排除隐性带菌和携带抗体等优点，本试验采用SPF小型猪，构建了致病性SS2的感染模型，通过临床症状观察、病理剖检、病原分离鉴定、PCR检测，证明该模型能够成功模拟自然感染状态，稳定性好，可用于SS2在动物体内动态分布规律、SS2的致病性、致病机制、机体免疫应答、疫苗的效果评价和相关药物筛选的研究，对于猪链球菌2型感染的防控具有重要意义。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1　菌株　致病性SS2 四川分离株ZY05719由南京农业大学动物医学院预防兽医系陆承平教授惠赠。

1.1.2　实验动物　选择2月龄SPF巴马小型猪，体重5 kg～6kg，由上海交通大学农业与生物学院人兽共患病与比较医学实验室提供。试验前检测猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、猪圆环病毒2型、伪狂犬病病毒、H1N1型猪流感病毒、猪肺炎支原体、弓形虫、布鲁菌、猪乙型脑炎病毒、猪细小病毒、猪副伤寒沙门菌、支气管败血波氏杆菌、猪痢疾蛇形螺旋体抗体以及猪链球菌2型，均为阴性。

试验前隔离室和猪笼等用具需彻底消毒。试验开始时，工作人员进入隔离室前，都必须进行手臂部消毒(1∶1000稀释的新洁尔灭)，然后换上无菌隔离服，并戴医用口罩和乳胶手套。

1.1.3　主要试剂　绵羊鲜血琼脂培养基购自上海美季生物技术有限公司；其余所有药品均为分析纯，购自上海试剂公司。

1.2　方法

1.2.1　菌液的制备　无菌条件下采用加入20 mL/L的小牛血清的THB液体培养基，进行增菌培养，37 ℃，180r/min，培养18 h。

1.2.2　动物接种　20头SPF巴马小型猪，随机分为2组，分别为空白对照组、ZY05719感染组，每组10头。各试验组分开独立饲养，保持相同的试验条件，即每天12h光照，12 h黑暗，相同的温度和湿度环境，饲料和饮用水高压灭菌。ZY05719感染组按照1×107cfu/(mL·kg－1)的剂量后肢肌肉注射四川分离株ZY05719菌液，空白对照组按照相同剂量肌肉注射无菌THB培养基。

1.2.3　临床症状观察和病理变化　各组动物连续观察7 d,7d后每周观察1次，至感染后的第3周，记录动物的临床症状、死亡时间；对于死亡动物进行剖检，肉眼观察病变；各组织取0.5 cm×0.5cm×1 cm的组织块，100 mL/L福尔马林固定，经酒精脱水、石蜡包埋、切片、贴片，HE染色，镜检。

1.2.4　细菌的分离培养　无菌采集试验组和对照组各样品的组织，绵羊血琼脂培养基上划线， 培养24 h～38h后，革兰氏染色，镜检。同时接种20 mL/L的小牛血清的THB液体培养基，37 ℃，180 r/min，培养24h后，涂片，革兰氏染色，镜检。

2　结果

2.1　临床症状

空白对照组饮食、体温等均正常，无明显的临床症状。

ZY05719感染组攻毒后，有2头猪为急性症状，表现持续高烧，无食欲，24h内死亡；皮肤多处有大片紫红色出血斑。其余猪均表现为亚急性症状，攻毒后12 h即可见体温升高，最高者可以达到40℃，这种高热状态可以持续5 d～7d；在攻毒后的第1天病猪不食或者少食，第3天所有的病猪都表现为食欲废绝，若病猪可以抵抗感染，存活下来，多在感染后的7 d～8d食欲开始渐渐好转；攻毒后第1天病猪喜跪、喜卧；第2天和第3天站立时呈交叉状；第4天和第5天后右肢关节肿胀明显，尔后关节症状逐渐消失，慢慢恢复正常；SS2感染最典型的脑膜炎症状，如兴奋过度，角弓反张，四肢呈划水状等多在感染后的2d～3d开始出现；另外，有些病猪还会出现呼吸困难，腹式呼吸。病猪都表现为进行性消瘦，有2头病猪在感染后的第7天死亡，其他猪在试验结束时即感染后的21d仍然存活，但是体况差，极度消瘦，很难转归。

2.2　病理变化

对空白对照组进行剖检，眼观和显微镜下观察组织切片均为正常组织状态，无病变。

对于急性死亡的猪，剖检可见血凝不良，黏膜、浆膜下出血，肺充血肿胀，脾肿大。石蜡切片可见淋巴结肿大、充血，脾脏出血，心肌出血(图1)。

A.心肌出血；B.脾脏出血；C.淋巴结充血、出血、水肿

A.Hemorrhage in cardiac muscle；B.Hemorrhage inspleen；C.Congestion，hemorrhage and edema in lymph gland

图1　SS2感染模型中病变组织HE染色结果

Fig.1　Histopathological lesions in the tissues of swine infectedwith S.suis serotype 2(HE staining)

对于亚急性病猪，体型消瘦，眼、嘴角有黏性分泌物，在其死亡或试验结束时剖检可见到肺淤血，心肺呈暗紫色，心壁有绒毛状附着；腹腔干燥，腹股沟淋巴结微肿大出血；尿道口积尿；脾脏呈暗紫色，边缘暗黑色，肝脏淤血稍肿大，肾脏被膜难剥离；盲肠有硬块，肠系膜淋巴结周边出血，肠壁点状出血；喉头和气管环有黏液；脑回出血水肿。组织石蜡切片，HE染色后可见脑组织有明显的出血、充血、炎性细胞浸润；肾脏出血，炎性细胞浸润。试验结束后仍然存活的那些慢性迁延的病猪，可见其脑组织内坏死，脑血管充血，胶质细胞增生，或者出现脑组织坏死；心肌纤维萎缩；肺实变，肺组织结构完全破坏，肺脏出现巨噬细胞浸润、成纤维细胞增生的现象；而扁桃体和肝脏则未见明显病理变化(图2)。

A.脑组织出血，炎性细胞浸润；B.肾脏出血，炎性细胞浸润；C.大脑血管出血，胶质细胞增生；D.肺实变，巨噬细胞和淋巴细胞浸润，成纤维细胞增生，肺组织结构完全破坏；E.大脑组织坏死；F.心肌纤维萎缩；G.扁桃体正常；H.肝脏正常

A.hemorrhage and inflamed cell infiltration in the brain；B.hemorrhage and inflamed cell infiltration in kidney； C.Vascularengorgement and colloid cell proliferation in brain；D.Macrophageand lymphcyte infiltration，fibroblast proliferation，consolidationof lung，totally ruined pulmonary architecture；E.Tissue necrosis inbrain；F.Muscle fiber atrophy in heart； G.Normal tonsil；H.normalliver

图2　SS2感染模型中病变组织HE染色结果

Fig.2　Histopathological lesions in the tissues of swine infectedwith S.suis serotype 2

2.3　细菌分离培养

观察血平板可见，空白对照组动物的各组织脏器均无细菌生长；无菌采集ZY05719感染组的扁桃体、脑、腹股沟淋巴结、肺脏、心血、肾脏，血平板划线，培养24 h～38h后，可见划线处均匀长出灰白色、光滑、整齐、半透明、针尖大小的菌落，有的呈α型溶血，液体培养基的管底部出现絮状沉淀。挑单菌落或菌液经革兰氏染色，显微镜下可观察到革兰氏阳性链状球菌。

3　讨论

国际上普遍认为SS2的致病性和致病机制都比较复杂，不同地域的分离株的致病性表现有差异，同一菌株感染不同地区的猪所致症状也不一样，甚至有报道不同的感染途径也影响到症状表现等。迄今为止，由于不同来源猪链球菌2型的致病性复杂多变，同时缺乏标准的猪链球菌2型猪感染模型，对于猪链球菌2型感染的致病机理尚未十分清楚。国内外对于该病致病机制的研究主要还是采用细胞系培养或猪全血培养等体外试验方法。动物试验大多采用小鼠、豚鼠、兔等。VechtU等用小鼠作为实验动物发现SS2感染存在种属特异性。Segura M等用CD1小鼠作为实验动物构建了SS2感染模型，虽然成功模拟了败血症和脑膜炎的症状，但是有些在大脑中发现细菌的小鼠并没有表现出明显的临床症状。家兔虽可感染SS2，但是其发病率和死亡率极其不规律，不适合作为SS2研究模型。吴全忠等用SS2江苏分离株HA9801感染豚鼠，建立了引起脑炎和败血症的动物模型，但是试验发现，豚鼠同群感染时间比仔猪晚，证明豚鼠的易感性低于仔猪，且该试验未证明SS2对豚鼠和猪的致病力完全一致，需要进一步的证实。国内外也有很多学者用猪作为实验动物，采用不同的感染途径，如呼吸道接种、静脉接种、口腔胃肠道接种等，但是这些试验易受隐性带菌和携带抗体等因素的影响，模型的重复性差，给研究带来了很多不确定性。GottschalkM等认为需要使用国际公认的动物模型、菌株等以判断各个研究的结果。本试验采用四川分离株ZY05719通过肌肉注射感染SPF巴马小型猪，构建了致病性SS2感染小型猪的动物模型。结果显示，SS2可人工感染巴马小型猪，重复性好，症状明显，其临床症状和病理变化等表现与自然感染情况下表现一致。另外，实验动物体型小，易于饲养和操作的特点，给模型的建立带来了更大的方便。因此，本试验建立的模型既可以用于其致病机制的研究，也可以作为一种标准用以判断菌株的毒力，具有重要的意义。