细菌生物被膜与抗生素耐药机制研究进展

摘　要：细菌引发的感染已成为感染性疾病的主要原因之一，具有耐药性和难治性的特点，而且还可以对抗机体的免疫清除作用，对人类和动物的健康造成很大的危害，也给人们生活的其他方面带来了越来越严重的影响，引起了基础和临床研究的极大关注。但是细菌生物被膜对抗生素的耐药机制目前还不十分清楚，现对近年来细菌生物被膜对抗生素耐药形成的几种可能机制进行综述。

关键词：细菌；细菌生物膜；耐药机制

细菌生物被膜(bacterialbiofilm，BBF)是细菌为适应自然环境，在生长过程中附着于固体表面而形成的特殊存在形式，是由多细菌组成的膜状结构，而并非单一细菌的膜成分。早在1676年，Antonievan Leeuwenhoek便从牙菌斑中观察到了细菌生物被膜的存在，但直到1978年，CostertonJ等才首先提出了生物被膜的相关理论。细菌生物被膜广泛存在于自然环境中，临床上细菌生物被膜可形成于各种生物置入材料表面及体内黏膜表面，具有极强的耐药性及免疫逃避性，是造成临床慢性感染的主要原因之一。

细菌生物被膜的生存方式不仅可以保护其中的细菌抵抗临床抗生素和工业设施中杀菌剂的作用，而且还可以对抗人体的免疫清除作用，从而对人类的健康造成了很大的危害，也给人们生活的其他方面带来了越来越严重的影响。关于细菌生物被膜对抗生素的耐药机制目前还不十分明确，本文对近年来细菌生物被膜对抗生素耐药形成的几种可能机制进行综述。

1　细菌生物被膜的特点

1.1　细菌生物被膜的定义

细菌生物被膜(BBF)，国内也有学者译为生物膜，是指附着于生命或无生命物体表面被细菌胞外大分子包裹的有机组织的细胞群体。它们是细胞间相互协调，以多细胞群体形式组成的复杂结构。

1.2　细菌生物被膜的特点

细菌生物被膜中水分可高达97%，除了水和细菌外，细菌生物被膜还含有细菌分泌的大分子多聚物、吸附营养物质和代谢产物及细菌裂解产物等。因此，细菌生物被膜中存在各种主要的生物大分子物质如蛋白质、多糖、DNA、RNA、肽聚糖、脂和磷脂等物质。

细菌生物被膜最大的特点是内部细胞功能的异质性(heterogeneity)，即细菌生物被膜不同部位的细菌展现不同的基因表达模式，发挥不同的功能。细菌生物被膜结构的一个基本模型是细菌被大量的外多糖包绕形成微克隆，在这些微克隆之间是充满水的通道(channel)，可用于运输营养物质和废物。细菌生物被膜垂直方向不同层面的细菌RNA含量、呼吸活性和蛋白质合成均不同，同时由于细菌所处微环境的pH和氧化还原电位等不同，可使遗传学上一致的细菌个体表现不同的特征，如产生毒素不同可使细菌生物被膜中一些细菌个体对宿主无危害，而另一些细菌则可能对宿主有致命威胁。

2　细菌生物被膜的形成及调控

2.1　细菌起始黏附

细菌生物被膜多细胞结构的形成是一个动态过程，细菌生物被膜细菌在各阶段表现不同的生理生化特性。细菌起始黏附是第一步，这种黏附作用主要是细菌表面特定的黏附素蛋白识别宿主表面受体的结果，其具有选择性和特异性。细菌黏附于表面可免于被流体带到不利于其生长的环境。在细菌黏附阶段，由于缺乏成熟的细菌生物被膜的结构保护，细菌抗性不强，抗生素药物的效果相对较好。

2.2　细菌生物被膜的发展

细菌黏附到表面后，调节其基因表达，在生长繁殖的同时分泌大量的胞外多糖。胞外多糖可黏结单个细菌形成细菌团块，即微菌落(microcolony)，大量微菌落使细菌生物被膜加厚，因此，胞外多糖分子的形成对细菌生物被膜结构的发展十分重要。此阶段，细菌对抗生素、紫外线抗性增加，还增加遗传交换效率、降解大分子物质能力，这些变化是细菌为适应自然环境而采取的生存策略。

2.3　细菌生物被膜的成熟

利用激光共聚焦显微镜(confocal scanning lasermicroscope，CSLM)观察到成熟的细菌生物被膜形成高度有组织的结构，该结构具有不均质性，它是由类似蘑菇形状的微菌落组成，在这些微菌落之间围绕着输水通道，可以运送养料、酶、代谢产物和排除废物等。因此，有人将成熟的细菌生物被膜的内部结构比喻为原始的循环系统。当细菌增殖时可因菌种营养附着的表面和环境的不同，形成疏松或致密以及厚薄不等的细菌生物被膜结构。

2.4　细菌生物被膜形成的调控机制

细菌生物被膜的形成过程受多种因素的影响，目前研究较为多的是生物被膜内部群体感应系统的调节作用。群体感应系统是指细胞密度依赖的菌细胞间的信号机制，可以协调细菌特定基因的表达，有利于细菌适应于环境压力，是细菌基因调节网络的组成部分之一。群体感应系统可调节毒力、二次代谢物的产生、细菌生物被膜的形成以及细菌的存活。革兰氏阴性菌和阳性菌群体感应系统的信号分子不同，革兰氏阴性菌依赖于化学小分子，而阳性菌则依赖于短肽分子。革兰氏阴性菌大多是利用酰基高丝氨酸内酯(acylhomoserinelactone，AHL)作为信号分子，AHL系统控制细菌克隆中的必需基因，在细菌生物被膜中，细胞紧密相连，使胞外信号达到高浓度，诱导控制基因的表达，导致生物被膜中不同多细胞克隆的形成和高度结构性群体的构建。AHL系统影响细菌生物被膜异质性、压力抗性等方面，对铜绿假单胞菌、嗜水气单胞菌、洋葱伯克霍尔德菌和液化沙雷菌生物被膜的形成产生影响和调控。革兰氏阳性菌通常通过专一的ABC(ATP-bindingcassette)蛋白分泌肽信号分子，肽信号分子被同源双组分转导信号的感应激酶蛋白分子识别，与胞浆反应调节蛋白相互作用，产生磷酸化与去磷酸化的系列反应而诱导相关基因的表达。葡萄球菌群体感应系统(staphylococcusquorum sensing system，SQS)中的辅助基因调节因子(accessory generegulator，AGR)，可调控数种细菌蛋白的表达，增强多种毒力因子的分泌。AGR系统的表达有利于葡萄球菌的致病性、表皮细胞的侵蚀和坏死并影响细菌生物被膜生长、发展和致病性。近期Merritt等在链球菌突变体研究中发现了S-核糖基高半胱氨酸酶(S-Ri-bosylhomocysteinaseLuxS)依赖的群体感应系统的作用，发现LuxS突变株形成的生物膜结构发生了改变，质地粗糙，基质间间隙增大，呈现颗粒状外观，第一次发现了LuxS依赖的群体感应信号在链球菌生物被膜形成过程中起重要的作用。

3　细菌生物被膜病和耐药机制

3.1　细菌生物被膜病

由细菌生物被膜引起的相关感染性疾病及慢性感染的反复发作称为细菌生物被膜病，又称菌膜病。菌膜病具有如下特点：细菌生物被膜首先在非活性物体表面(多见于医疗器械)，死亡的组织(如死骨碎片)或活组织(如心内膜)上形成；抗生素治疗可以通过杀死从黏附群体中释出的浮游细菌而抑制感染症状，但不能清除仍然埋藏在细菌生物被膜中的细菌，当抗生素化学治疗停止后，细菌生物被膜就会作为感染复发的“疫源地”，因此呈现相对静止期和急性发作期交替以及易复发的特点。细菌生物膜导致慢性感染的机制主要是对抗生素治疗和机体免疫清除的抵抗作用。

3.2　细菌生物被膜对抗生素的耐药机制

3.2.1　细菌生物被膜的屏障作用　细菌生物被膜的主要特点在于形成胞外多糖基质，其作用首先是阻止抗生素接触包裹于被膜内的细菌，但不同细菌生物被膜阻止渗透作用也不同，铜绿假单胞菌形成的生物被膜对环丙沙星、哌拉西林和过氧化氢的渗透有屏障作用；而氨苄西林和环丙沙星可透过肺炎克雷伯菌形成的生物被膜，利福平可透过葡萄球菌形成的生物被膜但却不能杀死膜内细菌。

3.2.2　细菌生物被膜的微环境改变　细菌生物被膜的典型特点就是营养物质浓度的微阶梯梯度，此特点同其抗药性息息相关。研究发现氧气在细菌生物被膜表面被消耗殆尽，导致其深处为厌氧环境，氨基葡糖苷类抗生素对微生物的作用在厌氧条件下要明显低于有氧条件。酸性代谢产物的局部聚集导致细菌生物被膜内部pH的明显差异，与细菌对抗生素的颉颃反应有关。某些物质的耗尽或某些代谢性抑制物的聚集都会导致细菌进入非生长状态，从而逃避抗生素的作用。目前大多数抗生素均是针对生长期的细菌，故对生长停滞的细菌作用不明显。当停止使用抗生素后，这些细菌就会生长繁殖，成为感染复发的根源。此外，细菌生物膜中渗透压环境的改变也会导致细菌细胞膜对抗生素通透性的下降。

3.2.3　类似芽胞细胞分化状态的形成　细菌生物膜中分化为类芽孢生长状态的细胞亚群具有广谱的耐药性。类芽孢生长状态的细菌，可像芽孢一样对物理和化学消毒剂有强大的抵抗力。在应用抗生素时，生物膜中的大多数细菌都会被杀死，仅有1%或更少的细菌存活，正是这种高度耐药的亚群，使得即使很薄不能对抗生素或代谢产物形成屏障作用的细菌生物膜，也发生了耐药现象。

3.2.4　细菌生长缓慢与应激反应　当被膜深层细菌营养缺乏时，其生长代谢速度缓慢，不再以指数增长，甚至不生长，却对抗生素的耐药性增加。Duguid等观察到浮游铜绿假单胞菌和膜内细菌对妥布霉素和环丙沙星的敏感性随生长速度的加快而增加，在低生长速度下，浮游菌和完整的生物被膜对环丙沙星同样耐药，但在高生长速度下，浮游菌比膜内细菌对环丙沙星更敏感。

近来有人提出细菌生物被膜内细菌的缓慢生长不是由于营养的限制，而是由于生长速度启动的普遍应激反应(General stressresponse)，应激反应使细菌的生理学改变，使其在各种环境下得到保护。

3.2.5　细菌传感效应　传感效应(Quorumsensing，QS)的调节是同种或不同种细菌对它们当前所处环境、群体密度的感知、交流和反应的一种方式，当环境变化时，如细菌密度改变或营养条件变化时，细菌表面产生和分泌某种特定信号分子，一般称为信息激素或自身诱导素；信号分子由于细菌数目的增加而持续产生聚集达到一定浓度后，细菌细胞内外感知并引发一系列的调节。目前已知有5类信息激素：AHL(acylhomoserine)、PQSs(heptyl-hydroxy)、AL-2、循环二肽(cyclicdipeptide)和寡肽(oligopeptide)，QS在细菌生物被膜的形成和成熟中起着一定的作用，但在细菌生物被膜的耐药机制中作用不明确，不同的细菌以及所用抗生素的种类不同，QS的耐药性也有所不同。

3.3　细菌生物被膜的抗免疫清除机制

3.3.1　细菌生物被膜的屏蔽作用　在细菌生物被膜中，大量的黏性基质包裹着细菌，形成了一个物理屏障，可以将细菌和机体免疫系统隔开，使机体的吞噬细胞和杀伤细胞及其所分泌的酶不能对细菌产生有效的攻击。

3.3.2　免疫复合物效应　虽然包裹细菌的黏性基质以及细菌释放出的抗原性物质可以刺激机体产生大量的特异性抗体，但这些抗体与可溶性抗原结合形成免疫复合物，沉积在感染病灶周围，吸引大量的中性粒细胞浸润并释放蛋白水解酶，从而引起宿主严重的免疫损害，但却无法对生物被膜中的细菌起作用。如肺部囊性纤维化病人由于先天缺陷，极易导致铜绿假单胞菌的肺部感染，其特点是免疫复合物介导的肺部的慢性炎症，包括补体的活化、局部高浓度的炎症前细胞因子以及低浓度的抗炎因子。对肺组织损伤的主要机制是由吞噬细胞释放的白细胞蛋白酶、髓过氧化物酶、氧基介导的炎症反应以及此类炎症反应对Ⅱ型辅助T细胞(Th2)的抑制作用。

4　细菌生物被膜感染的控制和预防

4.1　细菌生物被膜感染的控制

从细菌生物被膜中鉴定新的抗生素物质，发现新型的抗生素药物，如转肽酶基因几乎存在于所有的革兰阳性细菌中，它是一种很有价值的新药目标，能抑制转肽酶形成的药物预计能有效预防革兰阳性细菌引起的感染；Elafin为特异性的蛋白酶抑制剂，也是体内的一种天然生态抗生素，由它重组气道上皮细胞对铜绿假单胞菌生物被膜具有很好的抗菌作用。

研究人体健康微生物细菌生物被膜的组成及其与宿主和睦相处的分子机制，发展新型抗感染微生态制剂。通过竞争营养、空间和产生微生物颉颃物质，特异性的抑制病原菌的黏附、定植和在生物被膜中的代谢，克服由于传统抗生素的使用所引起的正常菌群失调、真菌二次感染和抗生素抗性等问题。

研究尚未发现的抗细菌生物被膜特征和新药的治疗方案。据报道，联合使用抗生素的效果良好，联合使用抗生素在杀死细菌和诱导铜绿假单胞菌释放内毒素具有很好的效果。

4.2　细菌生物被膜感染的预防措施

4.2.1　预防慢性感染　在细菌急性感染期应选用敏感抗生素给于足量疗程治疗，使之难以形成细菌生物被膜。手术植入生物材料后预防性抗生素治疗是现行普遍的做法，但并发症常会发生，因此并不提倡。在移植物相关性感染的预防措施中，使用无菌技术防止细菌的污染是被公认推荐的。

4.2.2　生物材料的抗细菌黏附　抗细菌黏附生物材料的策略主要是针对细菌菌落的形成。方法一是建立物理电屏障。用抗生素处理移植的生物材料并在表面加低电流或低频超声波，产生的电解质如质子、羟基离子、反应氧中间物、氧气和氢气可以增强抗生素对黏附至材料表面细菌的杀伤作用，这被称为生物电效应(bioelectriceffect)。已有研究验证了此方法对表皮葡萄球菌细菌生物膜形成的抑制作用，但需经临床试验验证。方法二是用抗微生物物质如抗生素或银离子包裹生物材料；以局部形成最佳浓度防止细菌黏附，如表面镀银的心脏人工瓣膜和导尿管。

5　展望

细菌生物被膜的研究使微生物学的发展迈出了重要的一步，即认识到微生物可以以多细胞的生命形式存在，并引导人们去认识微生物是如何形成一个具有结构性、协调性和功能性的高度组织群体。但是，细菌生物被膜内细菌的耐药机制目前还没有一个明确的解释，细菌生物被膜形成机制、形成过程中所需的条件和信号、细菌群体的功能性分工都需要进一步研究。当前，各种先进的生物技术被应用于细菌生物被膜的研究，例如，利用激光共聚焦显微镜和原子显微镜研究细菌生物被膜的结构和动态变化、利用报告基因和荧光探针了解细菌生物被膜的基因表达、利用基因芯片和双向电泳技术比较细菌生物被膜细菌和浮游细菌基因表达和蛋白组成的区别等。可以预见，随着细菌生物被膜研究的深入，人类将能更好地控制细菌性感染。