胸膜肺炎放线杆菌PCR检测方法的建立及临床应用

摘　要：为建立检测可疑病料中猪胸膜肺炎放线杆菌(App)的方法，针对App的RTX毒素(Apx ⅣA毒素)毒力基因长约449bp的片段设计引物，以App10个血清型的基因组分别作为模板，对PCR扩增条件进行优化筛选，并进行了特异性及重复性试验。对副猪嗜血杆菌、马链球菌兽疫亚种、多杀性巴氏杆菌的扩增结果为阴性，表明该PCR方法特异性强，建立了该菌的种属特异性PCR方法。以筛选出的优化条件，对22份临床可疑病料进行了检测。结果表明，建立的PCR方法特异、快速、稳定、敏感，优于传统的细菌学方法，可作为App可疑病料的检测方法。

关键词：胸膜肺炎放线杆菌；多聚酶链反应；特异性；检测

胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae，App)，原称胸膜肺炎嗜血杆菌(Haemophiluspleuropneumoniae，Hpp)，属于巴氏杆菌科嗜血杆菌属，后又根据其表型(phenotype)和DNA杂交水平均与放线杆菌属模式种密切相关，又归属于巴氏杆菌科放线杆菌属，命名为猪胸膜肺炎放线杆菌。由本菌引起的猪传染性胸膜肺炎是猪的呼吸道传染病，各种年龄的猪均易感染，常与巴氏杆菌等混合感染。病猪发热可达42℃，呼吸困难，食欲不振；剖检可见纤维素性胸膜肺炎，多呈两侧感染，65%的肺叶病变严重；发病率8.5%～100%，病死率0.4%～100%；App还可引起仔猪后躯麻痹。本病几乎遍及全世界所有养猪国家，流行日趋严重，成为世界性规模化养猪的重要疫病之一。本病在我国自1987年报道以来，广泛流行，且呈逐年上升趋势。

近年来，在血清学检测方面，国内外已设计了多种检测方法。猪传染性胸膜肺炎的诊断非常困难，传统上主要依赖病原分离和血清学检测，但由于App要求营养条件严格，不易分离培养，且难以与副猪嗜血杆菌、马链球菌兽疫亚种、多杀性巴氏杆菌等相区别；加之临床上大量使用抗生素，导致App的临床分离率很低。而App血清型复杂，仅依据血清学结果又不能对临床病例直接做出确诊。因此，临床诊断工作中迫切需要建立一种灵敏高、特异强、快速的App检测方法。近年发现App的ApxⅣA毒素具有致病性及种属特异性，存在于App所有血清型中，放线杆菌其他种属、嗜血杆菌和多杀性巴氏杆菌等均无此毒素。为此，本研究采用PCR方法扩增了ApxⅣA基因的部分片段，以建立一种检测临床病料中App的诊断方法。

1　材料与方法

1.1　标准菌株和病料

App1～App10型标准菌株、多杀性巴氏杆菌C48-84和马链球菌兽疫亚种C55100均购自中国兽医药品监察所，副猪嗜血杆菌Nagasaki毒株由上海市畜牧兽医站诊断中心细菌室保存。从江苏苏州、太仓、昆山，浙江嘉兴、嘉善、南浔、平湖等地，以及本市采集疑似猪传染性胸膜肺炎病死猪肺病料22份。

1.2　PCR方法的建立

分别挑取巧克力琼脂上生长的App1～App10型标准菌株，悬浮于100 μL的灭菌蒸馏水中，100 ℃水浴10min，冰浴冷却后，12 000 r/min离心10 min，取上清作为PCR模板。根据GenBank中已发表的ApxⅣA(基因序列号AF030511)序列，利用Primer5.0软件设计两条引物，上游引物(P1)为：5′-CGTATTTGGCACTGACGGCGA-3′；下游引物(P2)为：5′-CGGCCATCGACTCAACCATCT-3′，扩增片段长度约为449bp。PCR扩增条件经筛选和优化后，最后采用的扩增条件为：50 μL的PCR反应体系中含2 μL模板，5 μL 10×PCRbuffer，2.5 μL DMSO，各10 pmol的检测引物，4 μL 25 mmol/L MgCl2,0.5 μLrTaq酶，4 μL 2.5 mmol/L dNTP，用水补足到50 μL体系。PCR反应条件为：95 ℃ 2 min；94 ℃ 30s，57 ℃ 60 s,72 ℃ 45 s，循环扩增30次；72 ℃ 10 min。在10 g/L的琼脂糖凝胶上电泳观察结果。

1.3　特异性和重复性试验

采用上述方法对标准App1型、副猪嗜血杆菌、马链球菌兽疫亚种、多杀性巴氏杆菌基因组按上述条件进行PCR扩增检验其特异性。并对App1～App10型标准株重复扩增5次检测其重复性。

1.4　临床样品的PCR检测与NY/T537－2002检测

对上述临床采集的22份病料按常规分离要求直接接种到血琼脂表面，挑取生长的菌落参照上述PCR反应条件，设App1型菌作为阳性对照进行PCR检测。传统的细菌学方法检测按照猪放线杆菌胸膜肺炎诊断技术(NY/T537－2002)标准进行，常规分离要求直接接种到血琼脂表面，再用鸡表皮葡萄球菌作交叉划线，于烛缸中培养24h～48 h，注意观察溶血和卫星现象，取典型菌落进行革兰氏染色，最后进行生化特性鉴定。

2　结果

2.1　PCR扩增结果

分别以App1～App10型标准菌株基因组为模板，按上述条件进行PCR扩增，能扩增出特异的目的条带，大小约449bp，与理论值相符，结果见图1，对这10个型的扩增结果进行测序，同源性为100%。

2.2　PCR特异性和重复性扩增结果

分别以标准App1型、副猪嗜血杆菌、马链球菌兽疫亚种、多杀性巴氏杆菌基因组为模板，按上述条件进行PCR扩增，只有标准App1型能扩增出特异的目的条带，大小约449bp，与理论值相符，而其余3种细菌均未见到扩增产物(图2)。另外，对App1～App10型标准株进行了重复扩增，在5次重复性检测中，均可扩增出长为449bp的DNA片段，图略。

M.DNA标准DL 2 000；1～10.App1型～App10型

M.DNA Marker DL 2 000； 1-10.App type 1-10

图1　App1～App10型标准菌株PCR扩增结果

Fig.1　PCR results of App type1-type10 strain

M.DNA标准DL 2 000；1.App1型；2.副猪嗜血杆菌；3.马链球菌兽疫亚种； 4.多杀性巴氏杆菌

M.DNA Marker DL 2 000； 1.App type 1；2.H.parasui；3.S. equi subsp.zooepidemicus；4.P.multocide

图2　App PCR特异性扩增结果

Fig.2　Specificity of PCR detection of App

2.3　临床样品的PCR检测与NY/T537－2002检测

通过本研究中建立的PCR方法，将血琼脂表面的菌落悬浮于100μL的灭菌蒸馏水中，进行检测，得到3份阳性。按照NY/T537－2002检测，同样为这3份临床样品阳性，染色镜检2号和11号为革兰氏阴性杆菌，因子试验阴性，无溶血现象；17号为革兰氏阴性长丝状杆菌，V因子试验阳性，β-溶血；这3份样品的CAMP反应、尿素酶试验均为阳性，能分解木糖、甘露醇，不分解棉籽糖、阿拉伯糖，所以根据该标准得出结论：这3份样品猪胸膜肺炎放线杆菌阳性。具体的生化鉴定结果见表1。

表1　样品生化特性鉴定结果

Table 1　Identification results of samples’ biochemicalcharacteristics

注：①“＋”表示阳性；②“－”表示阴性。

Note：①“＋” menas positive； ②“－” menas negative.

3　讨论

App分离鉴定繁琐且不易培养，给猪传染性胸膜肺炎的临床诊断和实验室确诊带来了困难。本试验采用PCR方法扩增的基因ApxⅣA毒力基因，根据文献报道具有种属特异性，长约449bp，目的片段较短。特异性和重复性试验结果表明，本研究建立的PCR方法只能用于检测App，特异性强，敏感性高，具有广阔的应用前景。临床应用上，此PCR法与猪放线杆菌胸膜肺炎诊断技术(NY/T537－2002)检测结果完全相符，具有一致性，但PCR方法省去了细菌分离鉴定程序，操作更快捷。