摘 要：对狂犬病病毒CVS株糖蛋白基因进行克隆与测序，推导出相应的氨基酸序列。然后采用Gamier-Robson法和Chou-Fasman法预测糖蛋白的二级结构，用Kyte-Doolittle法、Emini法和Jameson-Wolf法分别预测蛋白质的疏水性、表面可能性和抗原指数，并综合分析预测糖蛋白的B细胞抗原表位。结果表明，该蛋白结构中含有少量的α螺旋、较多的β折叠以及较为丰富的转角区域，在序列的121～126、133～137、161～165、191～193、201～204、214～216、221～225、264～267区域或其附近最有可能是B细胞抗原表位的优势区域。
关键词：狂犬病病毒；糖蛋白；二级结构；B细胞表位
狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(Rabies virus，RV)感染引起的高度致死性人兽共患传染病，广泛分布于亚、非、欧、美等各大洲，一旦发病即引起100%死亡，严重威胁人畜的健康。RV基因组为单股不分节段的负链RNA，含5个大的开放阅读框，编码5 种结构蛋白，即核蛋白( N ) 、基质蛋白( M ) 、磷酸化蛋白( P ) 、糖蛋白( G )和转录酶蛋白( L )。
反向疫苗学是通过分析病毒的基因组序列来预测病原体的抗原信息，然后筛选出合适的候选抗原，进而研制出有效的疫苗。本研究在对RVCVS株糖蛋白基因序列测定的基础上，运用分子生物学软件对其二级结构和B细胞抗原表位进行分析和预测，为狂犬病反向疫苗学的研究提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
狂犬病病毒CVS株致死小鼠﹑JM109 菌株由本实验室保存。pMD 18-T载体﹑AMV 反转录酶、Premix TaqDNA聚合酶、RNA酶抑制剂、dNTP及限制性内切酶BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ、λ-EcoT14 Ⅰdigest、胶回收试剂盒及质粒提取试剂盒均为宝生物工程(大连)有限公司产品。RNA提取试剂盒购自Qiagen公司。其他试剂均为分析纯试剂。
1.2 引物设计与合成
参考GenBank中收录的RV CVS株G基因序列设计了一对引物，并在G1 、G2 划线处分别加入BamHⅠ、EcoRⅠ酶切位点。
上游引物 G1：5′-GCAGGATCCTTCCTCAGGTTCTT-3′
下游引物G2：5′-GACGAATTCTCACAGTCTGATCTC-3′
1.3 病毒RNA 的提取
取狂犬病病毒CVS株致死的小鼠1只，无菌剖检，取脑组织少许，加适量含抗生素的溶液进行研磨，用PBS 制成1∶5的悬液，反复冻融。然后以7 500 r/ min于4 ℃离心10 min，取上清液用于提取RNA。其他步骤按RNA提取试剂盒说明书进行。获得的RNA 于－20 ℃保存或直接用于反转录。
1.4 扩增 G 基因
使用合成的引物G1、G2，用AMV 反转录酶和Premix Taq DNA 聚合酶，进行RT-PCR反应扩增目的基因。
1.5 基因克隆与序列测定
将PCR 产物经10 g/L的琼脂糖凝胶电泳，100 V稳压电泳30 min后，用胶回收试剂盒回收1 575bp处的条带，连接到pMD 18-T载体，转化JM109 感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素的琼脂平板，置37℃培养过夜。挑取白色菌落于含氨苄青霉素的LB 液体培养基中，于37 ℃以250r/min摇床培养过夜后提取质粒，采用双酶切及PCR方法鉴定重组质粒，阳性质粒送宝生物工程(大连)有限公司进行测序，并进行序列分析。
1.6 糖蛋白二级结构和B细胞抗原表位的预测
应用Gamier-Robson方法和Chou-Fasman方法预测糖蛋白的二级结构，应用Kyte-Doolittle方法分析糖蛋白的疏水性，以及用Emini方法和Jameson-Wolf方法分别对糖蛋白的表面可能性和抗原指数进行预测。
2 结果
2.1 重组质粒的鉴定
用重组质粒作模板，用引物G1、G2进行 PCR 扩增和BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切，均得到了与目的基因大小一致的约1 575bp的片段，说明本试验中所克隆的目的基因已成功插入pMD 18-T 载体中(图1)。
M.λ -EcoT14 Ⅰ酶切DNA标准；1～2.重组质粒的双酶切；3.PCR产物
M.λ-EcoT14 Ⅰ digest； 1-2.pMD18-T-G digested by BamHⅠ＋EcoRⅠ；3.PCRproducts
图1 重组质粒的酶切结果
Fig.1 Restriction enzyme analysis of the recombinant plasmids
2.2 序列测定及分析
重组阳性质粒测序结果表明，狂犬病病毒CVS株G基因全长为1 575bp，编码524个氨基酸。G蛋白中含有56个碱性氨基酸，58个酸性氨基酸，165个疏水氨基酸和141个极性氨基酸。编码蛋白的分子质量为59ku，在pH 7.0时，G蛋白所带电荷为0.299。Protein Prediction在线软件分析发现G蛋白在56、223、338、499位含有潜在的糖基化位点。
2.3 G蛋白二级结构预测
Gamier-Robson方法是通过计算特定氨基酸残基在特定结构内部的可能性来预测蛋白质的二级结构的，Chou-Fasman方法是通过序列氨基酸残基的晶体结构来预测二级结构的，因此两种方法预测的结果有所不同。从图2中可以看出，用Gamier-Robson方法预测的G蛋白的较大的α螺旋区域有9个，较大的β折叠区域有22个，且分布比较均匀。用Chou-Fasman方法预测的较大的α螺旋区域有7个，较大的β折叠区域有11个。两种方法预测的共有的较大的α螺旋区域在60～67、287～307、342～348、400～409、426～440区段，其共有的较大的β折叠区域在5～11、78～86、91～98、139～144、350～355、377～383、457～462、467～476、498～503区段。在各β折叠单元之间存在长短不一且较为丰富的转角区域。
2.4 G蛋白的亲水性分析
从图3对G蛋白的亲水性分析结果可见，该蛋白含有众多的亲水性区域，分布较为均匀，尤其是98～150、186～236、480～495区段亲水性较高，表明这几个区域作为抗原表位的可能性较大。
A.α螺旋区域；B.β折叠区域；T.转角区域
A.α helix regions； B.β sheet regions； T.Turn regions
图2 两种不同的方法预测G蛋白的二级结构
Fig.2 Secondary structure of G protein predicted by two differentmethods
图3 G蛋白的亲水性分析
Fig.3 Hydrophilicity analysis for the G protein
2.5 G蛋白的表面可能性分析
用Emini方法对G蛋白的表面可能性分析显示，G蛋白大多数区域表面可能性较低或表现为负值，有10个区域较高，尤其124～128、200～204、483～499等区域的表面可能性值最高(图4)。
图4 G蛋白的表面可能性分析
Fig.4 Surface probability for the G protein
2.6 G蛋白的抗原指数分析
对G蛋白的抗原指数分析表明，该蛋白大多数区域的抗原指数都比较高，主要包括28～31、103～113、121～148、160～178、199～206、212～243、263～275、359～388、483～520区域(图5)。
图5 G蛋白的抗原指数分析
Fig.5 Antigenic index for the G protein
根据G蛋白的亲水性、表面可能性、抗原指数及二级结构的预测结果综合分析，该蛋白含有许多潜在的蛋白抗原决定簇，分布较为均匀，但在蛋白氨基酸序列的121～126、133～137、161～165、191～193、201～204、214～216、221～225、264～267区域或其附近区域存在B细胞抗原位点的可能性最高。
3 讨论
糖蛋白被认为是惟一诱导机体产生中和抗体的蛋白，也能刺激机体产生细胞免疫应答，可抵抗RV经外周和脑内途径的攻击，故近年来成为疫苗学研究的热点。
蛋白质的二级结构对抗原表位影响很大。α螺旋、β折叠等二级结构的化学键(氢键)键能较高，能够比较牢固地维持蛋白质分子的高级结构，且常处于蛋白质分子的内部，很难与合适的抗体嵌合，而β转角和无规卷曲是比较松散的结构，易于发生形变，以突出到蛋白表面，有利于与抗体结合，因此这些区域有成为抗原表位的可能性。按蛋白亲水性、表面可能性和抗原指数的预测结果显示，应用不同的方法，预测的抗原表位个数和抗原表位可能出现的肽段区域不同，但多种预测方法均显示有共同的肽段区域，结合二级结构的β转角和无规卷曲的预测结果表明，狂犬病病毒糖蛋白含有较多的B细胞抗原优势表位区域，主要集中在氨基酸序列的121～126、133～137、161～165、191～193、201～204、214～216、221～225、264～267区域。
本研究中使用的方法是基于单个氨基酸的性质进行预测的，但抗原表位又与蛋白质的高级结构密切相关，因此这个预测具有一定的局限性。本研究分析结果可作为确定糖蛋白潜在优势表位的参考，为狂犬病反向疫苗学的研究提供一定的理论依据。
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