高效液相色谱手性固定相研究进展

摘要：对近年来高效液相色谱手性固定相的研究进行了综述。重点介绍了手性固定相的分类、拆分机理和应用的新进展。讨论了各类手性固定相优缺点，提出了目前存在的问题、今后的研究方向和重点。
关键词：高效液相色谱；手性固定相；拆分机理
随着生物工程和生物科学的发展，手性拆分和测定引起了人们的普遍关注。尽管对映体间物理化学性质几乎完全相同，但它们的生化和药理作用却往往不同。这是因为生物本身内部的核酸、蛋白质及多糖都具有与其功能相适应的结构，它们常常对扬长避短一化合物的两种对映体表现出不同的响应。例如具有镇静作用的反应停(thalidomide，酞胺哌啶酮)，其有效成分是R构型，而S构型则具有致畸作用?。据统计，常用的2OO种药物中，大约有120种至少含有一个手性中心。而这些手性药物中有80％～90％以外消旋体形式在市场销售，存在巨大的潜在危险性。因此，对映体的拆分与识别对于生命科学和药物化学研究以及人类的健康具有十分重要的意义。
目前用于手性分离的方法主要有毛细管电泳法、薄层色谱法、亚临界及超临界流体色谱法、气相色谱法和液相色谱法。近年来，高效液相色谱法取得了令人瞩目的进展，已成为对映体拆分强有力的手段之一。而其中所用的手性固定相的是能否进行手性分离的关键。
l 手性固定相的分类
虽然液相色谱常被分为不同的分离模式，但实质上所有的分离模式都基于两个最基本的因素：即固定相的结构和组成，以及决定分离机理的固定相与流动相相互作用的性质。因而手性固定相(CSP)的制备则是手性分离的关键。目前所研究的HPLC-CSP主要可分为下列几类：
1．1 蛋白质手性亲和固定相
多数蛋白质CSP的分离机理目前尚不十分清楚，但是蛋白质CSP的手性识别能力可以归结为它们独特的空间立体结构特征。尤其是在对映体的手性识别过程中，三级结构所造成的疏水性口袋、沟槽或通道对手性拆分具有十分重要的意义。
七十年代初已有人将牛血清白蛋白键合在琼脂糖上，制成液相色谱用手性填料，拆分了DL-色胺酸。八十年代初，Alhnmark和Hellnanssor分别将BSA和a-酸性糖蛋(a-AGP)键合到微粒硅胶上制成HPLC用的CSP，商品名为Resolvosil和Enantio Pac。Hermanssor和Schill等以Enantio Pac柱拆分了酸、胺和β-氨基醇类药物如萘普生、双异丙吡胺、麻黄素、可卡因、阿托平等几十种药物，拆分效果良好，分离系数(a)可达1.1～4.0，柱的稳定性好，对温度和有机溶剂有较好的耐受性，长期保存在异丙醇中(12个月)，对拆分效果无明显影响。Resolvosil柱可用于拆分氨基及其衍生物、芳香亚砜、二苯乙醇及多种药如安定、华法林等。在国内，张鹏等用万古霉素制备的手性固定相用于对布洛芬手性对映体的拆分，也取得了不错的效果。周华等用L-脯氨酸衍生的衍生物作为高效液相色谱手性固定相，用于对4种N-3，5-二硝基苯甲酰-DL-氨基酸甲酯对映体色谱拆分，结果显示对映体选择性在1.04一1.18之间。兰州化学物理研究所的候经国在这一方面也做了深入研究。
1．2 环糊精型手性固定相
手性固定相拆分对映体的另一途径是将手性空穴键合到固定相表面，由此产生的客体-受体间的相互作用决定对映体的拆分效果。最常用的是环糊精手性固定相，环糊精手性固定相的分离机理主要基于包含型络合过程，这一机理表示分子的非极性部分被吸引到非极性空穴中，当被分离的分子存在芳香基团时，由于芳香基团与糖苷键上氧原子的作用产生立体选择的趋向，而线性或无环的烷烃以随机方式占据环糊精的空穴。
Ward将β-CD通过6～10碳的间隔基键合到微粒硅胶上，商品名Cyclobond I。这种CSP象切去顶端的锥形圆筒，边缘有羟基，内部为疏水性的内腔，只有当分子的大小正好使非极性部分进入腔内，极性基团与边缘的羟基产生较强的作用才能拆分。某些具有萘环和双环化合物可得到良好的拆分，如丹酰氨基酸、巴比妥类、乙内酰脲、金属茂等。单环化合物如扁桃酸、酪氨酸、麻黄素等也可拆分，使用范围广，仅次于Pirkle型GSP。流动相为甲醇-水或乙睛-水，γ-CD无拆分作用，a-CD仅对小分子有拆分作用。唐课文等合成了一种烷基化和硅烷化β-环糊糖手性固定相，用其分离了醇、酮、烯烃等一些对映体，取得了很好的效果。辛梅华等人将β-环糊精进行了乙酰化用于对肾上腺素类对映体的测定，也得到了不错的结果。
1．3 配体交换型固定相
这类手性固定相拆分对映体与手性配体流动相的拆分机理相同，只是手性配体键合到固定相基质成为手性固定相而已。其配体分子亦为具有手性活性的氨基酸如脯氨酸，金属离子多用Cu2+。Davank0v将L-脯氨酸键合到树脂上，经吸附CU(Ⅱ)、Ni(Ⅱ)或Zn(Ⅱ)后，可拆分氨基酸对映体。Gubity将L-脯氨酸和L-缬氨酸通过间隔基键合到硅胶上，制成HPLC用CSP，以CuSO4水溶液处理后即可用于氨基酸和二肽类的拆分。此类CSP已有四种商品：Chiracel WH，WM和Chiral hypro-Cu，Val-Cu。除上述氨基酸外，用为CSP键合基的尚有：L-l，2-二氨丙烷、β-羟基氨基酸、l-麻黄素、L-组氨酸、L-苯丙氨酸、L-氮杂-2-环丁烷羧酸、L-酒石酸、L-2-哌啶酸、及(一)-反-1，2-环已二胺。拆分化合物包括氨基酸、二肽、a-羟基酸及有关药物如a-甲基多巴、甲状腺激素等，a值1.10—8.0，配位基交换色谱的流动相多为水或磷酸、乙酸氨缓冲液，有时加入一定量的有机溶剂(乙腈)。为防止铜离子的流失，在流动相中加入适当的CuSO4，此类CSP亦可用于制备性分离。
1．4 高聚物手性固定相
HPLC聚合物CSP包括天然的聚糖类衍生物和合成的高分子手性聚合物。聚糖类手性聚合物主要包括纤维素、淀粉的衍生物(乙酯、苯甲酸酯、氨基甲酸酯)，作为HPLC的CSP广泛应用于对映体手性拆分，其中特别是苯基氨基甲酸酯衍生物具有较高的应用价值而广泛研究。这类手性固定相的优点除了作为天然的光学活性物质容易得到外，它们的葡萄糖单元的羟基易被取代和官能团化，且该类CSP的载样量大，在大规模制备级色谱应用上有很大潜力。
1973年，Hesse和Hagel首先制备了微晶纤维素三醋酸酯(CTA)，研究表明：在多相条件下制备的CTA具有较好的手性识别能力，这种手性识别能力来源于纤维素的晶体结构本身。当微晶纤维素三醋酸酯溶解于溶剂并涂渍在硅胶上时，其手性识别能力不同于原来的微晶纤维素，对某些对映异构体的光学拆分洗脱顺序是完全相反的，比如Troger碱，这种变化主要是由于在溶剂中的CTA性能与微晶结构时的CTA大不相同所致。
当各种纤维素酯、纤维素三苯甲酸酯及其衍生物涂渍在硅胶上时显示出较高的手性识别能力，根据三点作用原理，该类纤维素衍生物中最重要的手性作用位点是羰基，羰基与具有羰基的对映体通过偶极一偶极相互作用，与具有羟基或氨基的对映体发生氢键作用。通常．在纤维素的衍生物中大都还引入苯基，这有利于提高手性识别能力，常见的纤维素三苯甲酸酯的苯坏上取代基团有：2-CH3、3CH3、4CH3、4-OCH3、4-C(CH3)3、4-F3、3，4-（CH3）2、3，5-(CH30)2、3，5-C12等。
在所有的纤维素衍生物中，3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯显示出优越的手性识别能力。Okamato等曾用3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯作固定相对510种旋光物质进行拆分，这就是说，大约有60％的旋光物质能在3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯上进行拆分。
直链淀粉与纤维素一样也是d-葡萄糖单元构成，但直链淀粉被认为d-葡萄糖单元a键上存在一个螺旋结构而致使其结构更有序；同时，直链淀粉衍生物的手性识别能力与纤维素衍生物存在很大的差别。直链淀粉苯甲酸酯手性识别能力低，而三(3，5-二甲基苯氨基甲酸酯)即Chiralpak AD对绝大部分对映体显示最高的手性能力，X-射线结果分析表明，直链淀粉三(苯基氨基甲酸酯)有一个左端4折螺旋线。纤维素和直链淀粉手性识别能力不同的原因可能是由于葡萄糖单元构象不同，结构有序性存在差异。
Yashima等把直链淀粉的3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯衍生物区域选择性键合到硅胶上作为HPLC手性固定相结果表明：6-位键合到硅胶上比2-、3-位键合具有较高的手性拆分能力，但键合型比涂敷型CSP拆分能力低。Vinegar等认为将上述衍生物键合到硅胶上作为CSP可采用四氢呋喃和氯仿作流动相，可克服涂敷型CSP在此类流动相中溶解的问题。
Chankvetadze等讨论了直链淀粉的二甲基-、二氯-和氯甲基苯基氨基甲酸酯CSP的分离性能，表明直链淀粉的5-氯-2-甲基苯基氨基甲酸酯比相应的二甲基和二氯衍生物手性识别能力高；在苯基的2-位引入甲基，增加键合NH的比例，意味着增加吸着点的数目，同时降低了手性聚合物的规则性，但引入氯降低吸着点酸度，减弱对映体NH基相互作用。苯基氨基甲酸酯的2，5-甲基氯基衍生物优于相应的二甲基、二氯基衍生物，可能是上述作用平衡的结果；通过2-氯基与5-甲基比较表明Nit基的酸度对分子内的影响比作为吸着点与对映体相互作用更重要。
另一类手性聚合物是合成的高分子化合物，如三苯甲基丁烯酸酯类聚合物，因其螺旋结构而具手性。聚合物CSP的手性识别主要由于手性聚合物的高度有序结构，因此仅从聚合物的单体预测它们的性识别机理是困难的。三苯甲基丁烯酸酯类聚合物依靠其单向螺旋链获得旋光性，Okamoto将其涂于硅胶上，得到的CSP对刚性平面结构样品有良好的立体选择性，可用于酯、烃类、酰胺和含磷化合物的拆分。螺旋结构的固定相可能由于立体效应而产生拆分作用，当对映体依附在螺旋的不同层次，保留值不同产生手性拆分。
2 手性固定相的发展趋势
随着人们对手性化合物在医学工业和人体代谢方面重要性的了解，手性对映体的分离分析将会越来越重要。通过键合或者涂敷于硅胶上而制得的单一的聚合物作固定相的很少。这是因为一般的有机聚合物虽然耐pH范围广，化学稳定性高，但其刚性大减。采用无机微粒作载体，外面包覆聚合物层制得的固定相兼有普通聚合物的优点，又具有无机载体的刚性，从而使这类固定相得到了广泛研究，这也是高效液相色谱手性固定相的将来发展的个重要的方向。
由于外消旋体主要差异仅仅在于它们的立体化学构型，因此，HPLC的CSP对其手性识别能力也直接与映体本身的几何形状有关，对映体除了同CSP形成不稳定的复合物外。固定相的手性空间也是重要因素，性识别能力除了上述聚合物本身的结构特征外。其它多种因素如涂层溶剂、溶液pH值、操作温度等都会产生大的影响。