黄酮醇异构体的超临界流体色谱法分离

提要:用超临界流体色谱击进行了黄酮醇异掏体的分离研究。考察了温度、压力、流动相组成、柱条件等对分离的影响。在实验的温度范围40～60℃和压力范围15～30MPa内．进组化合物都能得到很好的分离，流动相组成是影响色谱分离的最显著的因素，磷酸的加入大大改变了各物质的保留行为，考察了三种硅肢基质键合相对分离的影响，发现苯基柱用于这组异构体的分离最为合适。
关键词：超临界流体色谱法；黄酮醇异构体；硅胶基质键合相
l 前盲
黄酮醇是黄酮类化合物中的一种，属于生物活性物质，具有一定的药用价值，对于黄酮类化合物的分离分析通常用液相色谱法。随着色谱技术的发展，超临界流体色谱法(supercridcal fluid chromatography，SFC)已成功地应用于异构体的分离。对于生化物质的超临界流体色谱分离常以二氧化碳为流动相，然而二氧化碳对于极性物质的溶解能力较差．在对它们进行分离分析时，往往需在其中加入极性有机溶剂，以增加流动相的溶解能力黄酮类化台物属于极性物质，用超I临界流体色谱法对其分离报道较少。Mortin等：在硅技柱子上分离了多甲氧基黄酮，Hadj-Mahammed利用毛细管超临界流体色谱法分离了多甲氧基和多羟基黄酮化合物。对于黄酮醇异构体的SFC分离至今未见报道。为了探索将SFC应用于黄酮类化台物的分离，拓宽SFC的应用领域。本文进行了黄酮醇异构体的分离研究。
2 实验
实验所用SFC装置由本实验室设计组装而成，原则流程。流动相输送系统由两台注射泵(Isco Model 1OODM)组成，一台用于输送液态二氧化碳，一台用于输送极性携带剂，两台泵由同一控制器控嗣。输送的两流体在一混合器内以一定的体积比混合，然后进入恒温色谱箱的预热管中。恒温系统由一气相色谱箱改造而成，内有流动相预热管和色谱柱。带有1μL定量管的Rheodyre 7520进样阀锃于色谱箱顶部。实验采用可变波长紫外检测器(Spectra 100)进行物质检测，检测波长为254nm。检测器后接一个背压阀，以保证系统的压力恒定并同时控制系统的流量，由泵出口至捡测器出口的压力降低于1.0MPa。色谱信号由色谱工作站记录。色谱柱有三根，内皆装填以硅腔为基质的5μm键合填料。一根为非极性的ODS柱，购自惠昔公司另两根分别为极性的CN基柱和Phenyl基柱，购自大连化物所依利特公司。三柱的尺寸皆为200mm×4.6mm。
黄酮醇异构体从日本化成株式会社购得，纯度为99%；二氧化碳购自北京氧气厂，纯度为99.995%；优级纯的无水乙醇和分析纯的磷酸，购于北京化学试剂广，纯度均可达到实验要求。
3 结果与讨论
下面从几个方面进行分离研究。
3．1 温度对分离的影响
表比较了三种温度条件下各物质的保留时间及各相邻物质间的分离度。从中可以看出，在不同的温度条件下各物质都可得到理想的分离。随着温度的升高，保留时间都有增大的趋势，并且相邻物质问的分离度也有所增大 为使各溶质能在较短的时间内得到分离，选择较低的操作温度比较理想．同时也可避免由于高温而引起的活性物质失活。
3．2 压力对分离的影响
表是在四种压力条件下的各物质的保留时间及相邻物质间分离度的比较。容易看到，在保持良好的分离情况下增大压力可缩短各物质的保留时间，因此在高压力下操作更有利于化合物分离。但考虑到设备对压力的承受能力，又不能选用太高的压力条件。本研究的压力范围为15～30MPa，尽管在各个压力条件下化合物的分离都能获得良好的效果。但建议采用较为适中的操作压力为宜。
3．3 流动相组成对分离的影响
在一定的温度、压力、柱条件下，研究流动相组成对这组黄酮醇化台物色谱行为的影响，发现单纯以二氧化碳为流动相。即使在35MPa压力下也不能将它们从柱子上洗脱出来；而在二氧化碳中加入一定量的乙醇，图2中的物质(2)和(3)可以很容易地从色谱柱子上洗脱出来。流出顺序是(2)在前，(3)在后，但物质(1)没洗脱出来，即使在二氧化碳中加入15%的乙醇也未能奏效，这是由它们的结构差异引起的。物质(1)的羟基紧邻羰基，二者相互作用增加了这个化合物的极性．同时增强丁与硅胶键合相上残留硅醇基团的相互作用。从而增大了洗脱难度。
为了寻找合适的流动相条件，作者由黄酮类化合物的液相色谱法分析大多在酸性条件下进行，这一现象受到启示，在携带剂乙醇中加入了0.5%磷酸。由于磷酸加入量很少，在整个流动相体系中所占比例远远低于液相色谱法中酸性组分的量，因而不足以对色谱系统造成腐蚀。在实验过程中也没发现腐蚀现象。这种新形成的流动相．大大改变了三种化合物的色谱行为。图中物质(1)不仅从柱上洗脱出来。而且其洗出顺序为最先 这可能是在酸性条件下，物质(1)中羟基与羰基的作用减弱。并且与键合相上残留极性基团的作用大大减弱。于是较快地从色谱柱上转移到流动相中。从而最先洗脱出来。
在流动相中加入极性携带剂．可起到以下两种作用：(1)掩盖键合相戏留的极性基团，(2)增加流动相的极性，从而增加流动相的溶解力。因此，流动相中携带剂浓度的变化必将影响溶质的保留时间。表给出了在相同的温度、压力、柱条件及流动相流速条件下。携带剂浓度对各物质保留时间的影响 从中不难看出，增大携带剂的量在不同程度上缩短了各溶质的保留时间及相邻物质问的分离度。但由于各溶质结构和性质的差异。携带剂对它们的影响程度并不完全相同。对于物质(3)，当携带剂的浓度由5%提高到10%时，其保留时间由23.34min缩短到7.29min，而物质(1)的保留时间则变化不太。仅由3.88min缩短到3.24min。
3.1 柱子对分离的影响
物质的保留行为与固定相的性质直接相关，不同的柱子对色谱分离会产生不同的影响。本文在相同的条件下考察了三种柱对这组异构体分离的影响，发现非极性ODS柱分离效果比较差；极性CN柱虽然能将它们分开，但各物质的保留时间都比较长，分离它们需要较长的时间Phenyl柱是比较理想的柱子．能在较短的时间内将它们分开。图给出三种物质在CN基柱和Phenyl基柱上的分离情况。
4 结论
在适当的色谱条件下，可将三种极性的黄酮醇异构体很好地分离。这表明超临界流体色谱法不仅适用于非极性物质的分离。而且也是极性物质分离分析中强有力的工具，在黄酮类化台物的分析、分离制备等方面将有广阔的应用前景。