测定方法
1、方法提要或原理
试料中残留的恩诺沙星、环丙沙星用不同pH 值的磷酸缓冲液提取,C18柱净化,流动相洗脱。以磷酸乙睛作为流动相,用高效液相色谱- 荧光检测法测定,外标法定量。
2、试剂和材料
恩诺沙星、环丙沙星、磷酸、氢氧化钠、乙腈、三乙胺、磷酸二氢钾;氢氧化钠溶液5. 0 mol/ L ；氢氧化钠溶液0. 03 mol/ L ；磷酸/ 三乙胺溶液0. 05 mol/ L ；
磷酸盐缓冲液(用于肌肉、脂肪组织)：取磷酸二氢钾6. 8 g ,加水使溶解并稀释至500 mL ,用5. 0 mol/ L 氢氧化钠溶液调pH 至7. 0。
磷酸盐缓冲液(用于肝脏、肾脏组织)：取磷酸二氢钾6. 8 g ,加水溶解并稀释至500 mL ,pH为4. 0；
恩诺沙星、环丙沙星标准储备液：准确称取恩诺沙星、环丙沙星对照品各50 mg , 用0. 03 mol/ L氢氧化钠溶液溶解并稀释成浓度为1 mg/ mL的储备液,置2～8 ℃冰箱中保存,有效期1 个月。
恩诺沙星、环丙沙星标准工作液 准确量取适量恩诺沙星、环丙沙星标准储备液,用乙腈稀释成适宜浓度的喹酸和氟甲喹标准工作溶液。
3、样品处理
提取：称取(2 ±0. 05) g 试料,置30 mL 匀浆杯中,加磷酸盐缓冲液10. 0 mL ,10 000 r/ min 匀浆1 min。匀浆液转入50 mL 聚丙烯离心管中,振荡混合5 min ,4 000 r/ min 离心10 min ,上清液转入另一25 mL 离心管中。用磷酸盐缓冲液10. 0 mL洗刀头及匀浆杯,转入50 mL 离心管洗残渣,搅匀,振荡,离心。合并上清液于25 mL 离心管中,备用。
净化：C18固相萃取柱依次用2 mL 甲醇、2 mL水润洗,润洗完毕后,准确量取适量备用液过柱,用2 mL 水洗,挤干。加2. 0 mL 流动相洗脱,挤干。收集洗脱液作为试样溶液,供高效液相色谱分析。
4、测定
标准曲线的制备：准确量取适量恩诺沙星、环丙沙星标准工作液,用流动相稀释成浓度分别为0. 002 ,0. 005 ,0. 01 ,0. 05 ,0. 1 ,0. 3 ,0. 5μg/ mL的恩诺沙星、环丙沙星标准溶液,供高效液相色谱分析。
色谱条件：色谱柱: C18 250 mm ×4. 6 mm ( i . d) , 粒径5μm ,或相当者。保护柱: 10GC4 ODS2 C18流动相: 0. 05 mol/ L 磷酸溶液/ 三乙胺-乙睛(82 ：18) ,用前过0. 45μm 滤膜。流速: 0. 8 mL/ min。检测波长: 荧光检测器，激发波长280 nm；发射波长450 nm。进样量: 20μL 。
在上述色谱条件下,恩诺沙星、环丙沙星的保留时间分别在11 min 和8 min 左右,标准溶液和试样溶液的液相色谱图见附录A 中图A. 1、图A. 2。
空白试验：除不加试料外,采用完全相同的测定步骤进行平行操作。
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