高效凝胶色谱法测定云芝多糖的分子量及其分布

摘要 目的：建立高效凝胶色谱法测定云芝多糖的分子量及其分布的方法。方法：用高效凝胶色谱法，以硫酸钠溶液作为流动相，示差检测，硫酸钠为抗衡离子用于抑制糖链上可电离单糖的电离。结果：测定4批不同来源的云芝多糖，重均分子量在4.O～7.8×10000Da，多分散指数在9.7～14.8之间。结论：云芝多糖中含有聚离子多糖，不同批号云芝多糖的平均分子量有明显的差异。
关键词：云芝多糖；高效凝胶色谱法；分子量；分布
云芝多糖系杂色云芝Polystictus Versieolor(L)Fr菌体提取物。云芝多糖能激活人体内巨噬细胞，从而具有增强人体免疫功能的作用，临床上用于治疗慢性乙型肝炎、免疫功能低下等疾病。临床使用的云芝多糖及其制剂没有对其分子量及其分布作质量控制，而多糖的生物活性与分子量、溶解度以及分子初级结构和高级结构等密切相关。本文应用高效凝胶色谱法测定了云芝多糖的分子量及其分布，并比较测定了几个不同批号的云芝多糖产品。
1 实验部分
1．1 仪器与试药
Waters 201型凝胶色谱仪(510泵、R401示差检测器)，美国Waters公司；RM6超级恒温水浴，德国；GPC色谱工作站，龙智达公司。硫酸钠，叠氮钠，氯仿，正丁醇，无水乙醇均为分析纯Mili-Q超纯水。右旋糖苷分子量对照品(分子量：2500Da～ 200000Da)，中国药品生物制品检定所。云芝多糖，本公司采购。
1．2 云芝多糖的纯化
取云芝多糖原料约5g，加水25ml，微热振摇使溶饵，用Sevage法去蛋白，即加入等量氯仿-正丁醇(4：1)充分振摇，离心，弃下层凝胶样物，取上层溶液同法处理，直至下层溶液不再出现凝胶样物质。取上层溶液加入4倍体积的无水乙醇，振摇，离心，弃溶液，取沉淀物，加水10ml振摇使溶解，再加入4倍体积的无水乙醇，振摇，离心，同法处理两次。取沉淀60℃减压干燥4h，取干燥物研细，备用。
1．3 色谱条件
色谱柱：TSK-GEL G3000PWxl，TSK—GEL GuradPWxl；流动相：0.05mol／L Na2SO4(含0.05%NaN3)，流速：0.6ml／min；检测器衰减：1／4，检测器温度25℃(由RM6超级恒温水浴循环水控制)；数据采集时间：22min。
1．4 测定方法
取纯化后的样品以流动相制成10mg／ml溶液，取右旋糖苷分子量对照品以流动相制成5mg／ml溶液，分别用0.5μm微孔滤膜过滤，各取20μl注入色谱仪。
2 结果与讨论
2．1 标定曲线
取重均分子量分别为200000、133800、84400、41100、21400、10000、4600和2500 Da的右旋糖苷分子量对照品溶液进样测定，记录峰值保留时间，标定色谱柱。以保留时间对分子量的对数作线性回归，得回归方程：Log(Mw)=8.992-0.3982tR，Mw为重均分子量，tR为保留时间(min)，相关系数为r=0.9983。
2．2 样品测定结果
测定4批云芝多糖的分子量及其分子量分布，
计算其重均分子量及多分散指数(D=／M )。
可见不同批号的云芝多糖其平均分子量及其分布有明显的差异，控制其分子量显得必要。虽然其凝胶色谱峰形相似，但由于其组分比例不同，从而导致分子量的显著差异。样品1、2高分子部分比例高，其平均分子量也高；样品3、4的中低分子部分比例高，其平均分子量也小。分布宽度大致相似，均较宽。
实验还考察了流动相中加入电解质对测定的影响，实验表明电解质(Na2SO4)的加入使云芝多糖的中分子部分的保留时间明显后移(图1A、B、C)，测得的重均分子量也比以0．05 NaNs水溶液作流动相测得的小得多，说明云芝多糖中含有聚离子多糖。在0.05%NaN3水溶液作流动相时，聚离子多糖由于糖链上可电离单糖的电离，使糖链过度伸展，从而分子尺寸变大，使测得分子量大大偏高。加入足够浓度的抗衡离子可以抑制糖链上可电离单糖的电离，使聚离子多糖恢复为普通多糖的性质。本实验中抗衡离子为硫酸钠。