地黄降糖颗粒质量标准研究

来源:作者:李若存，陈丹，夏红英 摘要：目的：建立地黄降糖颗粒的质量标准。方法：采用TLC法对处方中地黄、绞股蓝、苍术、玄参进行鉴别；用薄层扫描法测定菝葜皂苷元的含量。结果：在TLC色谱中检出地黄、绞股蓝、苍术、玄参；菝葜皂苷元在0.92～4.6 范围内显良好的线性关系，r=0.9998，平均回收率99.16％，RSD 为0.84％。结论：所建立的方法简便可行，重现性好，为地黄降糖颗粒质量控制提供了方法。
关键词：地黄降糖颗粒；菝葜皂苷元；质量标准
地黄降糖颗粒是中药三类新药，由地黄、知母、绞股蓝等制成，功能滋阴清热、健脾益气，用于2型糖尿病，证属阴虚内热兼气虚者。症见口渴喜饮、五心烦热、倦怠乏力、自汗、盗汗、气短懒言、心悸失眠、舌红少津、苔薄或花剥、脉弦或细数等。为有效地控制其质量，采用薄层色谱法对制剂中的地黄、绞股蓝、苍术、玄参进行了鉴别，并采用薄层扫描法测定了菝葜皂苷元的含量。该方法能有效控制该制剂的质量。
1 仪器与试液
CS-930薄层扫描仪(日本岛津)，定量毛细管(美国，Drummond公司)，PBQ-II型薄层自动铺板器(重庆南岸新力实验电器厂)，硅胶G(青岛海洋化工厂)，地黄、苍术、玄参对照药材；人参二醇、菝葜皂苷元对照品均由中国药品生物制品检定所提供，所用试剂均为分析纯。
2 定性鉴别
2．1 地黄的鉴别 取本品7g，加水5Oral，煮沸20min，放冷，滤过，滤液加醋酸乙酯萃取2次，每次20ml，分取醋酸乙酯层，置水浴上蒸于，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。同法制成地黄阴性对照液。另取地黄对照药材4g，加水5Oml煎煮二次，每次30min，滤过，滤液同法制成对照药材溶液。吸取上述三种溶液各lOμ1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯．醋酸乙酯(1：1)为展开剂，展开，取出，晾于，喷以二硝基苯肼乙醇试液。供试品色谱中，在与对照药材相应的位置上，显相同颜色的斑点。而阴性对照液无相应的斑点。
2．2 绞股蓝的鉴别 取本品12g，研细，加乙醇60ml，超声处理40min，滤过，滤液蒸于，残渣加45％硫酸乙醇溶液(7→100)15ml，加热回流2h，挥去乙醇，用氯仿10ml振摇提取2次，分取氯仿层，用适量无水硫酸钠脱水，滤过，滤液浓缩蒸干，残渣加氯仿lml使溶解作为供试品溶液。同法制成绞股蓝阴性对照液。另取人参二醇对照品，加氯仿制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。吸取上述三种溶液各8μ1，分别点于同一以0.5％羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，以环己烷-丙酮(2：1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以l0％硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。而阴性对照液无相应的斑点。
2．3 苍术的鉴别取本品5g，加水20ml使溶解，通过D101型大孔树脂柱(内径1.2cm，长15cm)，用水50ml洗脱，弃去水液，再用70％乙醇50ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加水lOml使溶解，加盐酸lml，加热回流lh，冷后，用苯20ml萃取，分取萃取层，蒸干，残渣加苯lml使溶解，作为供试品溶液。同法制成苍术阴性对照液。另取苍术对照药材3g，加水煎煮二次，每次3Oml，滤过，滤液，同法制成对照药材溶液。吸取上述三种溶液各10μ1，分别点于同一以0.5％羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，以苯-丙酮(8：2)为展开剂，展开，取出，晾干，在紫外灯(365nm)下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。而阴性对照液无相应的斑点。
2．4 玄参的鉴别 取本品10g，加丙酮4Oml，加热回流lh，滤过，滤液挥干，残渣加丙酮lml使溶解，作为供试品溶液。同法制成玄参阴性对照液。另取玄参对照药材2g，加丙酮20ml，同法制成对照药材溶液。吸取上述三种溶液各10μ1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯(3：1)为展开剂，展开，取出，晾干，在紫外灯(365nm)下检视，供试品色谱中，在与对照药材相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。而阴性对照液无相应的斑点。
3 含量测定
3．1 层析条件0.5％CMC-Na硅胶G薄层板，规格10cm×20cm，薄板厚度0.5mm，ll0℃ 活化0.5h。温度：25℃，湿度：60％ 。
3．2 扫描条件经光谱扫描后确定菝葜皂苷元λs=443nm，单波长反射式锯齿扫描，狭缝宽度0.4mm×0.4mm，SX=3。
3．3 对照品溶液的制备 精密称取菝葜皂苷元对照品约5.0mg，置lOml容量瓶中，加苯溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得。
3．4 样品溶液的制备 取本品约6.Og，精密称定，置锥形瓶中，加水4Oml使溶解，再加盐酸5ml，水浴上回流2.0h、放冷，加氯仿40ml，加热回流0.5h，放冷，分取氯仿层，水层再用氯仿分别萃取2次，每次40ml，合并氯仿部分，水浴挥干氯仿，残渣用苯溶解，转移至25ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，即得。
3．5 阴性对照液的制备 取除知母外的其余处方量药材，按制备工艺制备缺知母的阴性样品，按上述供试品溶液制备方法制成缺知母的阴性溶液。吸取阴性对照溶液、样品溶液和对照品溶液各4μl，分别点于同一薄层板上，按标准曲线的制备展开、显色，样品溶液色谱中，在与对照品溶液相应位置上，显相同颜色的黄色斑点，阴性对照品溶液无相应的斑点。
3．6 标准曲线的制备 分别精密吸取上述菝葜皂苷对照品溶液2、4、6、8、10μl分别点于同一块薄层板上，以苯-丙酮(9：1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以显色剂后，在70℃加热7～10min，至斑点显色清晰，取出，在薄层板上覆盖同样大小的玻璃板，周围用胶布固定。按扫描条件进行测定。以菝葜皂苷元的浓度(X)为横坐标，峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，其回归方程为：Y=10837.50X+770.546，r=0.9998。结果表明菝葜皂苷元在0.92～4.6μg范围内具有良好的线性关系。
3．7 稳定性试验 对同一块薄层板上同1个菝葜皂苷元斑点每隔20min扫描测1次，所得RSD为1.83％(n=5)。结果表明，在lOOmin内基本稳定。
3．8 精密度试验 同板精密度：精密吸取同一供试品溶液4μl×5点于同一硅胶G薄层板上，依标准曲线绘制方法测定，结果峰面积积分值的平均值为69816.58，RSD％为0.89(n=5)；异板精密度：精密吸取同一样品溶液4μ1分别点于5块不同的薄层板上，依法测定。RSD％为2.31(n=5)。表明精密度良好。
3．9 样品含量测定 用定量毛细管吸取供试品6μl ，对照品溶液4μl与8μl，分别点于同一块薄层板上，按标准曲线方法进行测定，用外标两点法计算供试品含量。
3．1O 加样回收率实验 精密称取已知含量的(批号20001215)颗粒剂约3g，分别精密加入菝葜皂苷对照品溶液3.0ml、4.0ml、5.0ml、13.0ml、15.0ml，按上述含量测定项下的方法测定含量.
4 讨论
地黄为方中君药，在TLC法中，我们拟采用梓醇化学对照品鉴别方中的地黄，但阴性干扰多，未获成功，后经反复试验，确立了本文的方法。据文献报道，从绞股蓝中分离到80多种皂苷，其苷元为人参二醇，或人参二醇的异构体。本方中含有知母皂苷、黄芪皂苷、绞股蓝皂苷，鉴别中成分相互干扰，所以我们确立了皂苷类水解，以人参二醇对照品鉴别方中绞股蓝的方法。
知母为方中臣药，主含菝葜皂苷元，本制剂采用薄层扫描法测定菝葜皂苷元的含量，样品处理方法简便，省时，结果准确；用苯．丙酮为展开剂，一次展开即可获得良好的分离效果。水解时间控制2h为宜，水解时间不足，皂苷水解不完全，测得菝葜皂苷元含量偏低。
中国药典2000年版一部171页规定，知母中含菝葜皂苷元不得少于1.0％，研制本品中，我们对多家药材公司出售的知母饮片进行菝葜皂苷元含量测定，达不到药典的要求，可能是加工过程中表皮部分损失较多，为了保证制剂质量和临床疗效，应尽量选择同一产地知母药材进行制剂生产，且在生产投料前测定原料含量。