关键词：薄层色谱；高效液相色谱\"乌头生物碱；动物实验
中图分类号：O658 文献标识码：A 文章编号：1000-8713（2002）01-03
乌头生物碱是一类常见的毒性强烈的毒物。它种类繁多，结构复杂，稳定性差，其有效成分及毒性随产地、季节、炮制方法不同而呈现较大的差异。在我国，乌头生物碱中毒的案件时有发生，尤其在中药炮制中服用过量及误服事件更为常见。在这类案件的实际检验中，较多的是对有毒植物及可疑药物进行检验，而对生物检材中乌头生物碱的检验少有报道。通过高效液相-光电二极管阵列检测器（HPLC/DAD）法及动物实验方法进行检验更为少见。笔者在几起死因不明而怀疑为乌头碱中毒案件中，分别对可以药物及死者胃内容物、肝脏进行检验，取得了较好的结果。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
高效薄层板（GF254（青岛海洋化工厂）；离心机，转速为4000r/min（上海手术器械厂）；高效液相色谱仪HP-1100 HPLC，带DAD（美国惠普公司）。
空白肝脏（取自乙醇中毒死亡案件的死者）；实验用鼠为15g~20g小白鼠，两周龄。
试剂：甲醇、乙腈为色谱纯；氯仿、无水乙醇、无水硫酸钠、冰醋酸、盐酸，均为分析纯；去离子水。乌头生物碱对照品（购自中国药品生物制品检定所）。
乌头生物碱标准溶液（100mg/L）：精确称取乌头生物碱对照品10mg溶于100ml无水甲醇中。碘化铋钾：取次硝酸铋200mg、碘化钾 5g、碘2g、浓盐酸1ml和冰醋酸1ml，加水溶解，稀释至250ml，置于冰箱内保存。
1.2 检材提取
取死者胃内容物5ml, 离心5min。取上清液调PH为8~9，用氯仿提取、无水硫酸钠脱水，置于60℃下KD浓缩器中挥干，备检。
取研碎的死者肝10g，加入2mol/L Hcl 20ml，在80℃水解2h，冷却，离心。取上清液调PH为8~9，用氯仿提取、无水硫酸钠脱水，在80℃下挥干，备检。空白肝脏的提取同上等量平行操作。
取可疑药物5g ，用15ml无水乙醇浸泡 24h，离心，取上清液挥干，备检。
1.3 检验
1.3.1 薄层色谱法（TLC）检验
吸附剂：硅胶G；展开剂：A为环己烷-二乙胺（体积比为9：1）溶液，B为环己烷-乙酸乙酯（体积比为1：1）溶液，C为苯-二氧六环-二乙胺（体积比为7：2：1）溶液；显色剂：碘化铋钾；
将上述检材提取物分别用甲醇200μl溶解，进行TLC分析。展开后将展开剂挥干，放入碘化铋钾显色3s，取出观察。
1.3.2 HPLC分析
色谱柱：1 Phenosphere CN 5μm(250mmx4.6mm ID);2 Pypersil 5μm C18 BDB(250mmx4.6mm ID).流动相 A：0.001mol/L KH2PO4+0.001mol/L 十二烷基磺酸钠； B：5%乙腈；C：甲醇。流动相梯度0min~10min, V(A):V(B):V(C)=65:5:30; 10min~20min,V(A):V(B):V(C)=40:14:46; 20min~25min. V(A):V(C)=15:85; 25min, V(A):V(B):V(C)=44:10:46.
取上述检材提取物分别用甲醇200μL溶解，取20μL进行HPLC分心。
1.3.3 标准工作曲线
配制乌头标准溶液2mg/L, 5mg/L,10mg/L,30mg/L,50mg/L,80mg/L, 100mg/L进行HPLC分析，以其峰面积Y对质量浓度X(mg/L)作标准工作曲线，得线性方程Y=-0.2805908+14.11653XM, r=0.9996 线性范围2mg/L~50mg/L。
1.3.4 动物实验
毒饵配制（按不同提取法分为3组）：
第一组 取可疑药物5g，置于10ml水中浸泡24，挥至3，备用。
第二组 取可以药物5g，置于10ml 1%乙酸红加热浸泡24h，挥至3mL，备用。
第三组 取可疑药物5g，置于15ml无水乙醇中加热浸泡24h，挥干，再用5ml 1%盐酸溶解，加碱至中性，浓缩至3ml备用。
取小白鼠9只，平均分为3组，禁食12h后，分别向各组白鼠胃中注入对应组别可疑药物提取液各1ml/只，结果第1，3组白鼠中毒死亡。
2 结果与讨论
（1）在几起案件中，我们首先用TLC对乌头生物碱进行检验。结果表明，TLC法简便易行，灵敏度高，最小检出量为0.3μg，可作为乌头生物碱检验筛选的首选方法。如果显色结果呈阴性，可作为否定此类药物存在的依据。
（2）由于乌头生物碱的种类繁多、结构复杂、化学稳定性差，故相同检材的不同提取处理方法得到的结果有较大差异。这一点，在TLC和HPLC 检验中表现得非常明显。不仅检材的Rf 值及tR值与标准乌头生物碱的Rf值及tR值难以吻合，甚至标准乌头生物碱由于产地不同、保存时间不同，其Rf值及tR 值也不尽相同。显然，不能依据Rf值及tR值对乌头生物碱定性。同时我们也发现，虽然HPLC检验中乌头类生物碱tR值变化复杂，难以控制和掌握，但其特定结构基团在紫外检测中的吸收波长比较稳定，峰形特征明显，特征吸收波长为（228±2）nm,(275±2)nm,且不随其tR变化而变化。经与检材肝脏腐败程度相当的正常肝脏的对照检验证实，肝组织中的内源性物质对检验没有干扰，故可作为乌头生物碱定性的重要依据。在我们的实验中，从中毒死者肝脏及胃内容物中均检测出乌头类生物碱成分，分离情况良好，吸收波长稳定，紫外吸收光谱特征明显。尤其在肝脏中检测出乌头碱成分更有着重要的意义。
（3）据文献介绍，乌头类生物碱中毒性最强的是乌头碱、中乌头碱、次乌头碱等双酯型生物碱。这类药物亲酯性强、毒性大，人口服4mg即可死亡。但在药物炮制、加工过程中，这类药物容易水解，失去苯甲酰基团，生成乙酰乌头碱，其毒性明显降低；再进一步水解，生成乙酰胺类物质，毒性进一步降低。这一观点在动物实验中的得到了体现，。用可疑药物色稀乙酸浸泡灌喂白鼠，白鼠未见死亡；而用同等重量可疑的水和乙醇提取液灌喂白鼠，受试白鼠全部死亡。可见，药物提取方法不同，即水解程度的不同，其毒性表现出明显的差异，这一特点显著区别于其他药物。
（4）据文献介绍，乌头生物碱的毒害作用主要作用于人、畜的心脏和神经系统，使其心率时常，周围神经先兴奋后抑制，甚至麻痹。我们的动物实验直观地再现了这一现象，中毒白鼠开始表现兴奋、躁动；随即产生麻木现象，行走困难，四肢无力，难以支撑身体；最后，四肢瘫痪，呈俯卧状死亡。此中毒症状特征明显、直观，与其他毒物中毒症状有明显的区别。此动物实验结果可作为乌头生物碱检验的一个重要依据和旁证。
（5）由于乌头生物碱种类繁多，有毒成分热稳定性差，且不一汽化，因此难以用常规的GC和GC/MS方法分析，在缺乏LC/MS 等检测条件下的定性比较困难。由于我们对生物碱各有效成分在体内的变化规律尚未弄清，故在检验中未进行具体定量分析，知识使用两根色谱柱（C18柱及CN柱）与DAD光谱图相结合进行了定性分析。
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