摘要：利用人血管内皮细胞的细胞核而建立的体外转录分析体系可灵敏地定量测定血管生成素促进的RNA转录。反应体系中血管内皮细胞核先在缓冲液中与血管生成素混合，然后加四种核糖核苷三磷酸混合物启动反应，并以CTP作为示踪剂确定新生RNA的产量。结果显示，该体外分析体系的最适反应温度为30℃ ，最佳反应时间是30 min，在此反应条件下血管生成素可定量促进RNA转录，并存在着剂量效应。研究发现，体系中过高浓度的血管生成素降解RNA产物，提示细胞具有控制该因子在细胞核内积聚的生物学机制，以保证其在细胞内恰当地发挥作用。抑制血管生成素诱导的RNA转录可能可以抑制血管新生，因而可能是治疗肿瘤的一个新的分子靶。
关键词：血管新生；血管生成素；RNA转录；分子靶
肿瘤的发生、发展和转移与新生血管的形成密切相关，切断血管的新生即“饥饿疗法”是肿瘤治疗的可行之路，因此寻找血管生成抑制剂是当前的研究热点之一。血管生成素(angiogenin)是迄今为止惟一一个基于其促进血管新生能力而被发现和分离纯化的血管生成因子(angiogenic factor)，且其促血管生成能力非常强。研究发现，血管生成素通过与血管内皮细胞表面的肌动蛋白或大小在170kD左右的可能受体结合，从而一方面激活细胞外周蛋白酶，降解基底膜和胞外基质，促进细胞迁移和侵入其他组织的能力，并介导细胞的粘附；另一方面激活第二信使和Erkl／2通路，刺激细胞分裂、分化。这些都是体内血管生成所必经的生理过程。此外，实验也发现胞外血管生成素可经过核转位进入细胞核，并最后聚集在核仁中与DNA结合，但具体的进核过程和在核内的功能仍不明了。核转位被称为第三信使r ，提示该过程与血管生成素的生物学功能有重要关系。
血管生成素是一个由123个氨基酸组成的分子量约为14 kD的单链碱性蛋白质。同源序列分析表明血管生成素与牛胰核糖核酸酶有33％ 的一致性，两者的晶体结构也非常接近。不过，血管生成素的核糖核酸酶活性很弱，比牛胰核糖核酸酶的活性低4到6个数量级。它是核糖核酸酶超家族中惟一一个具有促血管生成能力的成员，也是目前已知的所有血管生成因子中独具核糖核酸酶活性的因子。化学修饰、定点突变或区域突变分析表明，该酶活性对其生物学功能(诱导血管生成)是必不可少的。而作为一种核糖核酸酶，其底物应该是RNA，只是至今仍未发现血管生成素的天然底物 。因此，血管生成素细胞核内功能的发现、其如此微弱核糖核酸酶活性意义的阐明，是了解其作用机制的基础，并有可能发现新的筛选血管生成抑制剂的分子靶。
本研究利用细胞核连缀(run—on)转录方法成功地建立了研究血管生成素对核内功能的体外分析体系，并对其反应条件及影响因素进行了探讨，为血管生成素作用机制的研究提供了可行的技术平台，还可能用于血管生成抑制剂的体外筛选和评价。
l 材料和方法(Materials and Methods)
1．1 材料
重组人血管生成素的表达和纯化参照文献进行。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)购自Promega公司(美国)；原代人脐静脉内皮细胞(HUVEc)购自Cell Systems公司(美国)；人内皮细胞无血清培养液(HE—SFM)购自Gibco BRL公司(美国)；胎牛血清(FBS)为Hyclone公司产品(美国)。其他试剂无特别指明则均为进口分子生物学级(molecular grade)或分析纯。
1．2 方法
1．2．1 细胞培养： HUVEc用含5％ FBS和5 L bFGF的HE—SFM 培养液在37℃、5％CO2中培养，每两天更换一次培养液。实验采用第3～11代的细胞。
1．2．2 细胞核的分离：培养细胞经胰蛋白酶(BioWhittaker公司，货号17—161E，美国)消化处理后，500 g离心5 min收集细胞。经HBSS(Biowhit．taker公司，美国)缓冲液两次洗涤后，用RSB(含有10 mmol／L NaC1、3 mmol／L Mgcl2、3 mmol／L DTr的10 mmol／L Tris．HC1缓冲液，pH 7．5)以2×107个/mL的细胞密度重悬细胞，冰浴10 min后加NP．40至终浓度为0．3％ 以裂解细胞。1000 g离心5min收集细胞核。分别用RSB和NSB(含有20％ 的甘油、90 mmol／L KC1、5 mmol／L Mgcl2、0．2 mmol／LDTr、0．2 mmol／L EDTA的50 mmol／L HEPES缓冲液，pH 7．9)洗细胞核一次。以≥108个／mL的密度将细胞核重悬于NSB溶液后，液氮中保存。
1．2．3 核连缀转录分析：在100 L含约4×105个细胞核的预冷NSB转录反应缓冲液中加入一定量血管生成素，然后加入1／10体积的核糖核苷三磷酸混合物(NTPs，其中ATP、GTP和UTP各3mmol／L，CTP为0．3 mmol／L)和10μCiCTP(NEN公司，美国)启动转录反应。在一定温度下反应一定时间后，酸性酚抽提终止反应。总RNA用含有2 mol／L NH Ac的2．5倍体积乙醇沉淀后溶于30 L的无RNase水中，用CHROMA SPIN一10DEPC—H2O spin column(Clontech公司，美国)除去游离CTP，然后通过6％ 聚丙烯酰胺凝胶电泳或直接经液体闪烁计数仪(Beckman公司，美国)测定RNA的放射性强度以分析新合成的总RNA。同时，以水(空白对照)或相同剂量的溶菌酶、bFGF或牛胰核糖核酸酶A代替血管生成素加入转录反应混合液作为试验对照。为建立最佳反应条件，实验摸索了上述反应体系在不同温度(22、30、37和45℃ )、不同时间(0、2、5、10、30、60 min)和不同血管生成素剂量(0、0．001、0．01、0．1、1、2和5 mg／L)下的产物生成情况。
2 结果(Results)
由于血管生成素是一个分子量为14 kD的小分子蛋白质，可以通过核孔自由扩散进入细胞核，因此我们认为可用体外核连缀转录反应来研究血管生成素在核内的一些功能。本实验将细胞核与血管生成素混合后，在不同条件下加入核糖核苷酸混合物启动转录反应，并以CTP标记新合成的RNA分子。在分离、提纯获得总RNA后，以聚丙烯酰胺凝胶电泳后放射自显影方法或产物的放射性强度测定方法分析新生成RNA 分子的大小和产量，以最佳反应条件建立血管生成素对核内功能的体外分析体系。
2．1 反应最适温度的确定
固定方法1．2．3所述反应体系中的血管生成素浓度为1 mg／L，分别选择22℃ 、30℃ 、37℃ 和45℃作为反应的温度，保温30 min后终止反应。在除去反应产物中的游离CTP后，通过液闪仪进行放射性同位素计数来测定新生总RNA的合成量。为直观起见，将不同温度下空白对照(以纯水代替血管生成素)的新生RNA量设为100％ ，血管生成素的活性如图1所示。结果明确显示血管生成素可促进核内RNA的转录，且在30℃时血管生成素的相对活性最强，表明本核连缀转录体系的最适反应温度是30℃ 。
2．2 反应最适时间的确定
为确定反应的最适时间，保持体系中血管生成素的浓度为1 mg／L不变，选择反应温度为最适温度30℃ ，分别反应0、2、5、10、30、60 min。然后分离总RNA，以放射性计数表示RNA的生成量。各反应时间下血管生成素的相对活性见图2。结果显示随反应时间的延长，RNA量逐步上升，到30 min时合成量达到最大值，约是对照的142％ 。而60 min时血管生成素促进的RNA合成量反而下降，可能是由于RNA的合成-降解平衡向降解方向移动。我们选择30 min作为本核连缀转录体系的最佳反应时间。
2．3 血管生成素的剂量效应
为确定反应体系中血管生成素的最佳浓度，研究了最适反应温度和最佳反应时间条件下血管生成素与总RNA生成量间的量效关系。将不同量的血管生成素与约4×10 5个细胞核混合后，加入N11P混合物在30℃启动核转录反应30mn。反应产物的液闪仪计数结果显示，血管生成素与新生RNA间存在明显的剂量效应(图3)，即随血管生成素量升高，RNA生成量也增多。为分析新生RNA的分子大小，取血管生成素为0、1、2和5 mg／L时的产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，放射自显影照片显示当血管生成素浓度达到5 mg／L时，RNA出现降解，即近加样孔的大分子RNA减少，相应地条带下半部分的小分子RNA增多。这是因为血管生成素本身具有核糖核酸酶活性，在高浓度时可能有RNA的非专一性降解发生。考虑到实验的可行性，本核连缀转录体系选择1 mg／L作为血管生成素的反应浓度。
2．4 反应体系的建立
综合以上结果，将血管生成素对核内功能的体外分析体系确定为：1 mg／L血管生成素与约4×10 5个细胞核混合后，加入N11P混合物在30℃启动核转录反应30 rain。在此反应条件下，加血管生成素的反应产物黑度明显强于无血管生成素对照(图5)，说明该因子可进入细胞核促进RNA的转录。将电泳条带割下后用液闪仪定量产物的放射性强度，计算表明1 mg／L血管生成素时新生RNA总量比空白对照高出约50％ 。为了确证血管生成素作用的专一性，选择等电点(pJ)和分子量均与其相似的溶菌酶和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)作为对照，放射自显影结果显示(图5的3和4)其黑度与无血管生成素对照接近，说明它们在本反应体系中对转录无影响，换句话说，本体外转录体系中RNA转录的增加是由血管生成素特异作用引起的。血管生成素是核糖核酸酶超家族中唯一具有促血管生成能力的蛋白质，但牛胰核糖核酸酶A(图5的5)由于其强大的酶活力，将反应体系中的RNA降解，故不能判断其促转录活性。以液闪仪测定的总放射性强度显示加牛胰核糖核酸酶A并不增加总RNA生成量(结果未显示)。
3 讨论(Discussion)
本工作成功地建立了适合血管生成素对核内功能研究的体外分析体系。以CTP作为示踪物，在最适温度30℃下反应30 min，可在体外实现快速、灵敏、定量地检测血管生成素对RNA的转录促进这一核内功能。本方法为血管生成素作用机制的研究、血管生成素生物学功能抑制剂的发现和非正常血管新生的阻断，提供了一个可行的研究系统。以血管生成素为靶目标发现的具抗肿瘤活性的小分子抑制剂65828 L9 可以在本体系中完全抑制血管生成素促进的RNA转录(未发表数据)，说明本体外分析体系可代替传统方法筛选、分析血管生成素相关的抑制剂。
碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)也是一种促血管生成因子，同样经核转位发挥其生物学功能 ，但在本反应体系下它并不刺激RNA 的转录。Bonneu等 证明，bFGF通过结合酪氨酸激酶Ⅱ(CK II)的B亚单位来调节rDNA的转录。CK II是一种丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，在调节细胞生长的过程中起作用 ，而作为核仁重要成分的核仁素是CK II的作用底物。因为核仁素的磷酸化与核糖体的生成有相关性，因此，认为bFGF可能通过CK II一核仁素途径来刺激rDNA基因的转录L1 。因此，虽然血管生成素和bFGF都是血管生成因子，都经过核转位促进RNA的合成，但其作用机制是不同的。bFGF通过和核内蛋白质的相互作用间接调节rRNA的转录，而血管生成素直接与核仁区的DNA结合 ，可能是直接作为一个反式作用因子促进RNA的转录。
在实验中发现高浓度的血管生成素(如5 mg／L)降解其本身促进合成的RNA，这说明血管生成素的作用靶细胞必然存在一种调节、控制该因子进入细胞量的机制，以实现既生成血管新生所必需的RNA，又不降解产物分子，确保血管生成素发挥正常的生物学功能。事实上，我们在研究血管生成素具有不同核糖核酸酶活性的突变体时已经发现，一定程度的核糖核酸酶活性也是该因子行使其生理活性所必需的；过强或过弱的酶活性突变体均丧失促血管生成 或RNA合成的能力(未发表结果)。基于以上数据，我们推测血管生成素不仅作为反式作用因子促进RNA的转录，而且可能参与转录后RNA的加工、剪接。
已知很多类型的肿瘤病人血液中血管生成素的浓度异常升高，也在肿瘤细胞株中发现过高浓度的血管生成素，表明它可能与肿瘤的发生、发展和恶化密切相关 J。在动物实验中，血管生成素的结合蛋白质(肌动蛋白)、天然抑制剂RI、单克隆抗体或反义寡核苷酸等均可抑制肿瘤的生长和恶化，提示可通过中和血管生成素抗癌 。目前的关键问题是寻找专一、高效的有临床应用价值的血管生成素抑制剂或拮抗物，而这只有从作用机制的研究中来探索。我们认为，血管生成素促进RNA转录这个生物学过程可能是一个研发抗肿瘤药物的新筛选体系；借鉴李凌等 建立的可实时观察肿瘤细胞生长和血管生成的动物模型，可直接检验所获抑制剂对肿瘤和血管生成的抑制作用。