摘要 本文以强阳离子交换色谱（SCX）作第一维，反相色谱（RP）作第二维，以一个10 通阀直接连接两支色谱柱，构建正交的SCX/RP二维液相色谱系统，并以珠蛋白水解产物的分析对其加以评价。样品首先由第一维阳离子交换色谱（Hyperil SCX, 100mm ×4.6mmI.D.）在pH 4.0的磷酸盐缓冲体系中以0.5mL/min的低流速洗脱分离，洗脱产物通过10通阀直接富集在反相分析柱（Hypersil BDS C18, 250mm × 4.6mmI.D.）顶端，切换10 通阀后进一步进行反相分析。阳离子交换色谱采用不连续的逐步增加盐浓度的19步台阶梯度方式洗脱，切割转移样品组份后再进行第二维分析。二维液相色谱系统的分辨率、峰容量都得到提高，出峰数量达到690多个，系统峰容量达到5643。二维液相色谱系统均采用常规尺寸的色谱柱，可以处理大进样量的样品，对生物样品的制备纯化有一定的指导意义。
关键词 二维液相色谱，峰容量，珠蛋白
随着生命科学的发展，对分离分析技术提出了越来越高的要求，同时也促进了分析方法的发展。高效液相色谱因分析速度快、分辨率高的特点广泛应用于生物化学样品的分离。对复杂组份的分离，传统的色谱方法受到峰容量和分辨率的限制，而组合不同模式构建多维系统是解决这一问题的有效途径。二维液相色谱（two-dimensional liquid chromatography, 2DLC）是利用两种不同分离机理的色谱进行样品的正交分离。二维液相色谱大大提高了整个系统的分辨率和峰容量，在蛋白质组学、药物分析中得到了广泛的应用。二维液相色谱大多使用两支或多支色谱柱，样品经过第一维分离后以一定的切割方式进入第二维色谱继续分离。通常柱间的切换转移由切换阀完成，其中阀的选用有4 通、6 通、8 通、10 通等，而切割后样品的储存由样品环或色谱柱的富集完成。近年也出现了无接口的整体两相式二维系统，如多维蛋白组识别技术（MudPIT）中的“鸟枪”（shotgun）技术，即在一只色谱柱内依次填充两种不同分离机理的色谱填料，无需连接接口等。本文设计了一个简单的二维液相色谱系统，克服了阀切换接口中储样难的特点，同时也克服了整体两相式二维系统中洗脱流动相不易控制的难点，采用一个10通阀直接连接第一维和第二维两支色谱柱，简化了流路设计，提高了系统分离能力。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
1.1.1 仪器
P200Ⅱ高压梯度液相色谱仪（大连依利特分析仪器有限公司），包括P200 Ⅱ高压恒流泵，DG 230(4)在线脱气机，Echrom 2000 色谱工作站，UV 228 紫外可变波长检测器等；CONSTAMETRIC 4100 四元梯度泵( 美国热电公司)；EV750-102 2 位10 通切换阀（Rheodyne 公司）；Model C3860A 超声仪(CBL Photoelectron Technology Co. Lid.)；Delta 320 精密酸度计（METTLER TOLEDO INSTRUMENTS）等。
1.1.2 试剂
乙腈（色谱纯，山东禹王实业有限公司）、三氟乙酸（TFA）购自Sigma 公司，其他试剂如磷酸二氢钠、氯化铵等均为分析纯（购自沈阳市联邦试剂厂）。实验用水为MillQ 制得超纯水，流动相配制后均经过0.45 μm水系微孔滤膜过滤。样品由猪血提取的珠蛋白经胃蛋白酶水解后冷冻干燥备用（大连化学物理研究所1805 组提供）。
1.1.3 色谱柱及分离条件
第一维强阳离子交换色谱柱采用Hypersil SCX(100mm × 4.6mmI.D.)，流动相pH 4.0，A 为5mMNaH2PO4+1％乙腈，B为A ＋ 1.0mol/L NH4Cl，流速为0.5mL/min。分19步洗脱，前18步分别采用0B％、0-2B％、2-5B％、5-15B％、15-20B％、20-30B％、30-40B％、40-50B％、50-55B％、55-60B％、60-65B％、65-70B％、70-75B％、75-80B％、80-85B％、85-90B％、90-95B％、95-100B％各洗脱7min，最后一步采用100B％洗脱20min。第二维反相色谱柱采用HypersilBDS C18, 5 μ m (250mm × 4.6mmI.D.)，流动相A为含0.1％TFA 的水溶液，B为含0.1％TFA 的乙腈，梯度条件为1-1-5-40-99-99-1-1B%(0-4.9-5-50-55-65-65.1-85min)，流速为1mL/min，检测波长为214nm。
1.2 系统的构建
本文采用SCX/RP模式构建正交的二维液相色谱系统，第一维SCX 根据样品所带电荷的不同进行分离，第二维RP 根据样品极性的差异进一步分离，其流程如图1 所示。样品进入第一维SCX 后，利用逐步增加盐浓度的缓冲液在较低的流速下洗脱，通过一个10 通阀的有效转移，将SCX 洗脱的每一部分样品在线地逐步导入第二维RP中继续分析并检测。在图1中阀的实线位时，SCX洗脱的流动相及一部分样品组份通过10 通阀直接进入RP分析柱，其中样品组份富集在RP 柱的顶端，而含盐的流动相不保留进入废液系统，与此同时反相流动相直接进入检测器。当SCX洗脱完成后，停止SCX 泵，同时切换10 通阀，如图1中虚线位所示，反相流动相进入RP 分析柱，梯度洗脱分析已富集的样品组份。反相分析完成之后，切换10通阀进入实线位，同时启动SCX泵，用增加了盐浓度的流动相洗脱SCX，并将样品组份富集在RP柱顶端，SCX 洗脱完成后停泵，同时切换10 通阀再进行反相分析，如此循环。
二维液相色谱的关键是如何有效地将第一维洗脱的样品组份导入第二维色谱中，根据对SCX切割方式的不同分为中心切割方式及整体切割方式。中心切割方式是将第一维洗脱中感兴趣的样品组份导入第二维，而整体切割方式是将第一维洗脱的样品组份全部导入第二维中继续分析。显然，整体切割方式能得到全部样品组份的信息，而中心切割方式只分析其中的目标组份。在近年蛋白质组样品的大规模高通量分析中，因整体切割方式能获得较多的样品信息而在全二维液相色谱中广泛应用。其中切割、转移第一维样品的方法有离线及在线两种方法。离线方法即切割SCX洗脱产物并收集在一定的容器中，之后再进行RP分析，常用于中心切割的二维液相色谱中。而在线方法通常使用整体切割方式将第一维洗脱的样品全部导入第二维中继续分析，其中切割转移的接口有阀控制的样品环储存形式、平行柱富集分析形式及捕集柱富集转移等。
在不同的接口中，洗脱、切割第一维的方式也不同。在阀切换控制的样品环储存或平行柱富集分析接口形式的二维液相色谱中，其关键是两个样品环或两支平行柱交替储存、分析第一维洗脱产物，通常等时间切割第一维洗脱产物，第二维色谱的分析时间不能大于储存或富集第一维洗脱产物的时间，因此第二维色谱要求快速分析，而第一维色谱采用低流速线性梯度洗脱。在捕集柱接口的二维液相色谱或“鸟枪”技术中无接口整体两相式二维液相色谱中，因第二维的分析时间较长，第一维不能再采用等时间切割的线性梯度洗脱方式，通常采用不连续的逐步增加盐浓度的台阶梯度洗脱方式。
在本文设计的二维系统中，对第一维的洗脱、切割也采用了不连续的逐步增加盐浓度的台阶梯度洗脱方式。样品中等电点（PI）较小的组份在SCX 中不保留，用0％B（不含NH4Cl）等度洗脱7min并富集在RP分析柱中，RP 分析完成之后切换10 通阀，之后采用18步逐步增加盐浓度的线性梯度方式依次洗脱，即0-2B％、2-5B％、5-15B％、15-20B％、20-30B％、30-40B％、40-50B％、50-55B％、55-60B％、60-65B％、65-70B％、70-75B％、75-80B％、80-85B％、85-90B％、90-95B％、95-100B％各洗脱7min，为了彻底清洗SCX中保留作用较强的样品组份，最后一步采用100B％洗脱20min。每一步由SCX洗脱的样品组份富集在RP柱并进一步分析检测。
2 结果与讨论
2.1 一维反相色谱分析
在进行二维分析之前我们首先进行了一维SCX及RP分析条件的优化选择。在选定的反相色谱分离条件下进行样品的分离，结果如图2 所示。可以看出反相色谱的分辨率还是很高的，因此我们利用反相色谱作第二维，而离子交换色谱因其较高的柱容量作为第一维。在一维反相色谱中虽然出峰120 多个，但还是有很多峰重合在一起没有分开。为进一步洗脱RP分析柱中的盐份等，二维系统中反相梯度程序中又增加了5min 的脱盐步骤，利用有机溶剂含量较低的流动相（1％B）去除残留在捕集柱及系统中的盐份等。由图2的一维反相分析看出，样品大多在40B％的有机溶剂浓度下出峰，因此在二维分析中进一步调整RP梯度程序为5-40B％（45min）。
2.2 二维液相色谱的分析
二维液相色谱的优点是能极大地提高样品的分离空间。在实验条件下的二维分析结果如图3 所示，系统分辨率大大增加，样品的出峰数量增加到692个。系统峰容量是描述系统分离能力的指标，从图2一维反相色谱的分析看出，RP的峰容量为279，样品经过SCX 的19次切割，因此整个二维液相色谱的系统峰容量是5643。
实验中也探讨了第一维切割次数对二维分离的影响，发现随着切割次数的增加，二维分离出峰的数量也增加。如实验中采用5 次切割的方法（0、50、250、500、1000mM NH4Cl 分别等度洗脱），分离效果不理想。又逐步增加切割次数至12 步（0、20、50、150、250、350、500、600、700、800、900、1000mM NH4Cl分别等度洗脱），出峰数量达到220多个。而进一步增加切割次数至19 步，出峰数量大大增加达到692 个。这与Vollmer等的研究结果一致，他们指出，对组成相对简单的样品较少的切割次数就够了，但对组成相对复杂的样品切割次数越多分析效果越好。继续增加对第一维的切割次数或许可以进一步增加样品组份的出峰数量，但是相应的分析时间也成倍增加。
如前讨论，采用阀控制的接口形式虽然有可以根据分离目的及仪器要求灵活组合的优点，但同时增加了管路连接，使用样品环储存接口受第二维分析时间的限制，使用平行柱富集分析接口要求消除两柱之间的差异，而捕集柱富集接口不仅要考虑其富集能力还要求不影响第二维的分离。而“鸟枪”技术中的整体两相式色谱柱可以直接与质谱连接，取消了接口切换阀、样品环或捕集柱等，减小了系统的死体积，但在这种技术中因为两种色谱填料直接相连，当进行第二维反相分析时其流动相同时也经过SCX填料，不可避免的对SCX中保留的样品组份产生影响。在本设计的系统中，不使用样品环或捕集柱，仅用一个10通阀直接连接第一维及第二维两支色谱柱，简化了流路设计，同时第二维的洗脱分析不会对第一维产生任何影响。值得注意的是本文第一维及第二维均使用常规尺寸的色谱柱，系统中虽然使用一个10通阀增加了阀流通及管路连接的体积，但对第二维4.6mm ID的常规柱及1.0mL/min 的流速来讲，增加的系统死体积可以忽略不计。使用常规尺寸的色谱柱构成的二维液相色谱系统不仅仪器要求简单，还可以处理大进样量的样品，根据分离要求也可以灵活的调整色谱柱的尺寸，对生物样品的制备纯化有一定的指导意义。