HPLC法测定薯蓣属3种植物中薯蓣皂苷的含量

　　目的：建立薯蓣属3种植物福州薯蓣、绵革j彝、穿龙薯蓣根茎中薯蓣皂苷的含量测定方法。方法：药材粉末经95％乙醇回流提取、水饱和正丁醇萃取后，采用HPLC法进行测定。色谱柱：Kromasil C18(250mm×4.6 mm，5μm)，流动相：乙腈-水(41：59)，流速：1.0mL/min，柱温：室温，检测波长：203nm。结果：薯蓣皂苷与其他成分分离良好。线性范围为10.0～200.0μg/mL (r=0.9997)。高、中、低浓度的平均回收率分别为97.9％，99.1％，102.5％。结论：方法简便、准确、重现性好，可用于薯蓣属药材的质量控制。
关键词：薯蓣属；薯蓣皂苷；HPLC
薯蓣属(Dioscorea)为薯蓣科中最大的一属。
在我国，此属植物人药历史悠久，其中福州薯蓣(D．futschauensis Uline ex R．Kunth)、绵革薜(D．septemloba Thunb)、穿龙薯蓣(D．nipponica Makino)均收载于中国药典2000年版一部。福州薯蓣和绵革薜的根茎习称绵革薜，具有利湿去浊、祛风除痹之功效，用于淋病白浊、白带过多、湿热疮毒、腰膝痹痛 。穿龙薯蓣的根茎习称穿山龙，具有活血舒筋、消食利水、祛痰截疟的功效，用于风寒湿痹、慢性气管炎、消化不良、劳损扭伤、疟疾、痈肿 。薯蓣属植物根茎中主要含有薯蓣皂苷等甾体皂苷类成分。由于薯蓣皂苷元是制药工业的原料，对于该属植物的质量控制多只涉及薯蓣皂苷元一种成分，但是获得皂苷元须经药材酸水解、萃取、调节pH等步骤，操作烦琐且常有副反应发生，收率不稳定。近年来，薯蓣皂苷等甾体皂苷在抗癌、降血糖、免疫调节、防治心血管疾病等方面的作用日益引起全世界的关注 。目前为止，对于皂苷类成分的研究，多停留在结构确证与药理活性方面，质量控制方面较少，已有研究多采用重量法 、薄层扫描法等方法考察该类药材或相关制剂中总皂苷或单体皂苷的含量。
本文采用HPLC法对薯蓣属3种植物中的主要成分薯蓣皂苷(dioscin)进行含量测定，该法不仅灵敏度高，专属性强，操作简单易行，而且将质量控制指标与活性成分相结合，为该属植物的质量控制提供了新思路、新尝试。
1 仪器与试药
Shimadzu高效液相色谱仪(LC-10AD泵，SPD-10A紫外检测器)；浙大智达N2000色谱工作站。BP210S电子天平。
薯蓣皂苷对照品为自制。经IR、MS、HNMR、CNMR确证结构为薯蓣皂苷 。峰面积归一化法计算纯度>99％。
甲醇、乙腈为色谱纯，水为重蒸水(自制)，乙醇、正丁醇为分析纯。
3种药材购自沈阳天益堂药店，经本校孙启时教授鉴定分别为福州薯蓣(D．futschauensis Uline exR．Kunth)、绵革薜(D．septemloba Thunb)、穿龙薯蓣(D．nipponica Makino)的根茎。药材经40℃干燥后，粉碎成粗粉，过40目筛，备用。
2 方法与结果
2．1 色谱条件与系统适用性试验色谱柱：Kromasil C8(250mm x4.6mm，5μm)，流动相：乙腈-水(41：59)，流速：1.0mL/min，检测波长：203nm，
柱温：室温，进样量：20μL。理论塔板数按薯蓣皂苷色谱峰计算不小于10000，分离度大于1.5，拖尾因子0.95。
2．2 对照品溶液的制备
精密称取薯蓣皂苷对照品10mg，置10mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成1.000mg/mL的对照品溶液。
2．3 供试品溶液的制备分别精密称取福州薯蓣
药材粉末2.2g、绵革薜药材粉末1.0g、穿龙薯蓣药材粉末0.1g，置100mL圆底烧瓶中，以20倍体积量的95％乙醇回流提取2次，每次1h。提取液滤过后蒸干，残渣以水15mL分次溶解，转移至分液漏斗，以水饱和正丁醇萃取4次(20，20，10，10mL)，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇溶解并定容至25mL量瓶中，摇匀，过0.45μm L滤膜，取续滤液，即得。
2．4 线性范围考察
精密吸取“2．2”项下的对照品溶液0.1，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0 mL于10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得10.0，40.0，80.0，120.0，160.0，200.0μg/mL的溶液，注入液相色谱仪，记录薯蓣皂苷色谱峰面积。以色谱峰面积Y对溶液浓度X(μg/mL)作图。计算回归方程为：Y=3.132×1000X 一8.020×1000，r=0.9997。
说明本方法在10.0—200.0μg /mL 范围内线性
关系良好。
2．5 精密度试验
取“2．4”项下浓度为120.0mL 的对照品溶液，重复进样6次，记录薯蓣皂苷色谱峰面积，计算RSD为0.7％(n=6)。
2．6 重复性试验
精密称取福州薯蓣药材粉末6份，每份2.2 g，按“2．3”项下平行制备供试品溶液，外标两点法计算薯蓣皂苷含量，平均含量为0.105％ ，RSD为2.7％(n=6)。
2．7 稳定性试验
取“2．3”项下福州薯蓣供试品溶液1份，分别于0，4，8，12，16，24h依法测定，计算RSD=1.3％(n=6)。结果表明供试品溶液在24h内比较稳定。
2．8 加样回收率
精密称取已测知含量的福州薯蓣药材粉末1．1 g，共9份，每3份为一组，置100mL圆底烧瓶(已分别精密加入“2．2”项下的对照品溶液0.6，1.2，1.8mL，水浴挥去溶剂)中，按“2．3”项下方法处理后进样。结果每组薯蓣皂苷的平均回收率分别为97.9％，99.1％，102.5％；RSD分别为2.1％，1.7％，2.0％(n=3)。
2．9 样品测定
按“2．3”项下方法对薯蓣属3种药材进行处理，每种药材平行制备3份溶液，注入液相色谱仪，记录薯蓣皂苷色谱峰面积；同时取浓度分别为40.0，160.0μg/mL的对照品溶液进样。以外标两点法计算薯蓣皂苷的含量。色谱图。
3 讨论
3．1 该属植物中所含甾体皂苷类成分种类繁多，结构相似，且处于末端吸收，分离难度较大。对于液相色谱条件，曾考察了Hypersil Cl8、Diamonsil Cl8、Kromasil Cl8、Kromasil C8等不同填料的色谱柱，不同比例的乙腈-水、乙腈-磷酸水溶液(203nm)，乙腈-甲醇-水(210nm)等流动相，结果发现以Kromasil C8为固定相，乙腈-水(41：59)为流动相，在203nm检测时，峰形及分离度好，灵敏度高。通过二极管阵列检测器检测，色谱峰纯度良好，分析方法具有专属性。
3．2 采用超声提取法，考察了甲醇及30％，50％，70％，95％的乙醇作为提取溶剂的提取效果，发现以甲醇及95％乙醇为溶剂，薯蓣皂苷的提取率较高且二者相当，但95％ 乙醇提取物中干扰峰较少，分离度较好，故采用95％乙醇为提取溶剂。
3．3 以95％乙醇为提取溶剂，考察了超声提取、索氏提取及回流提取的提取效果，发现回流提取效率最高，以药材2O倍体积的溶剂提取2次，每次1h，可将药材中薯蓣皂苷基本提取完全。
3．4 样品经溶剂提取后，考察了直接进样、正丁醇一步萃取后进样、***一正丁醇两步萃取后进样、***一丙酮沉淀后进样，以及提取液过氧化铝柱除杂后进样、过大孔树脂柱除杂后进样等样品预处理方法，发现正丁醇一步萃取后基线较平稳，杂质干扰少，操作简单，重现性好，而且损失小。
3．5 从测定结果看出，3种植物虽为同一属，但薯蓣皂苷的含量不尽相同，其中穿龙薯蓣富含薯蓣皂苷，另外2种含量较小。薯蓣属植物中有效成分为总皂苷，而薯蓣皂苷为主要成分，共有成分。将结构相似的有效部位转化为含量较大、结构明确的单一成分进行定量，既能对该属药材的综合品质进行评价，又快速、操作简便，因此是可行的。