大黄含量测定方法介绍（芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚）

大黄为蓼科植物掌叶大黄Rheum palmatum L.唐古特大黄Rueum tanguticum Maxim,ex Half.或药用大黄Rheum offuinale Baoll.的干燥根及根茎。2005版《中国药典》收载的含量测定方法为HPLC法，以芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚为对照品。大黄的有效成分为大黄素、大黄酚、大黄酸、芦荟大黄素、大黄素甲醚及其甙类等蒽醌类成分。有关大黄及其制剂有效成分含量测定方法报道很多，如比色法、薄层-紫外分光光度法、HPLC法等。

一、高效液相色谱法
⑴ 2005版《中国药典》大黄含量测定项：
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.1%磷酸溶液（85：15）为流动相，检测波长为254nm，理论板数按大黄素峰计算应不低于1500。
供试品溶液的制备：取本品粉末（过四号筛）约0.15克，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取蓄滤液5ml，置烧瓶中，挥去溶剂，加8%盐酸溶液10ml，超声处理2分钟，再加三氯甲烷10ml，加热回流1小时，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10ml，合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解，转移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取蓄滤液，即得。

⑵ 大黄素的含量测定
《中国药典》2005版大黄含量测定项：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-0.1%磷酸溶液（85：15）为流动相。检测波长为254nm。对照品为芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚。大黄样品前处理：甲醇回流提取—8%盐酸超声—三氯甲烷回流萃取。
王曙东，费建红，腾英博，谢虞异，陈安兰采用HPLC法测定了升血灵片中大黄素的含量。色谱条件同⑴，检测波长：439nm。仪器：1525-2996高效液相色谱分析仪(美国Waters公司)柱Lichrospher C18(150 mm×4.6mm，5μm)。
李长新，苏德龙，刘相辉，张 强，李桂红，国晶采用HPI C法测定养血安神糖浆中大黄素含量，色谱条件同⑴，检测波长436nm。仪器：Dynamax UV-D Ⅱ紫外检测器；Dynamax SD-200泵；Dynamax色谱工作站。
周静安，徐玲笑采用RP-HPLC法测定苁蓉通便口服液中大黄素的含量，色谱条件同⑴。在样品处理时分别采用以下方法进行比较：① ***萃取法；②通过D101型大孔树脂柱吸附法；③ 甲醇沉淀杂质法，对同一批号的苁蓉通便口服液进行提取、分离，并按含量测定方法测定供试品溶液中大黄素的含量。结果3种方法测定结果相差不大，而以***提取法峰形较好，杂质干扰少，且基线平稳。虽然将样品采用通过D101型大孔树脂柱吸附法测定大黄素的含量结果与***提取法相似，但该方法样品提取操作方法烦琐、费时。用甲醇沉淀杂质法，虽然方法简单，但杂质沉淀不完全，图谱中杂质峰响应值过大。故采用***萃取法，操作方便，结果准确可靠。
黄园,张志荣,邹敏采用HPLC法测定黄桔胶囊中大黄素的含量。流动相：甲醇-水-高氯酸(80：20：0.1)，流速1.3mL／min，检测波长286nm，柱温：35℃ 。仪器：日本岛津LC-10A高效液相色谱仪，shimpackCLC-ODS(150mm×4.6mm id 5 )色谱柱。样品处理时曾用甲醇-盐酸回流法提取总大黄素后直接进样，但样品峰始终有明显干扰，不能较好分离。故采用甲醇提取，盐酸水解，***萃取的方法提取总大黄素，样品峰得到较好分离。
朱丽，刘向前采用HPLC法测定益龄精口服液中大黄素的含量。流动相：乙腈-水-冰醋酸(60：40：1)；检测波长：437nm；样品处理参照《中华人民共和国药典》2000年版一部更年安片项下含量测定方法.
HPLC法单独测定大黄素的含量时，文献报道所采用的色谱条件多为药典所载的条件。流动相为甲醇-磷酸系统，也有用乙腈-磷酸系统的；检测波长多为254nm，其它的多为上面介绍的。文献报道的大黄中蒽醌衍生物的提取方法多为将样品用适当溶剂回流提取，除去溶剂后氧化水解，再以有机溶剂萃取。酸溶液多为盐酸和硫酸。

⑶ 同时测定大黄素和大黄酚的含量
《中国药典》2005版大黄含量测定项：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-0.1%磷酸溶液（85：15）为流动相。检测波长为254nm。对照品为芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚。大黄样品前处理：甲醇回流提取-8%盐酸超声-三氯甲烷回流萃取。
赵莉，晁若冰测定了大黄通便胶囊中大黄素和大黄酚的含量。色谱条件同⑴。仪器：LC-IOAT vp高效液相色谱仪，SPD-M10A vp光二极管阵列检测器，Class-vp色谱工作站(日本岛津)。用Luna 5 u Cl8(2)柱(150 mm×4.6 mm，ID)，ODS预柱Phenomenex ODS guard cartridge system，4.0mm×3.0mm，ID)。样品先用甲醇回流提取，提取物在2.5 mol/L硫酸溶液中加热水解，再用氯仿提取后进行测定。
张华，雪秦岚，赵宏科，赵海云采用HPLC测定血脂灵片中大黄素、大黄酚的含量。色谱条件同⑴，检测波长428nm。仪器：高效液相色谱仪(包括P200Ⅱ型高压恒流泵，UV-200Ⅱ型紫外检测器，Echrom98色谱数据处理工作站)，Shim-Pack型C18分析柱(200mm×4.6mm，5μm)
常军民，高宏，张煊，赵军，堵年生采用HPLC测定枝穗大黄中大黄素和大黄酚的含量。色谱条件同⑴。仪器：美国Waters 2690高效液相色谱仪，Waters 2487双波长检测器，Waters millennium s 色谱工作站(Waters corporation)。
魏有良，杨志一，霍彬科采用HPLC法测定化症回生片中大黄素和大黄酚的含量。色谱条件同⑴。样品处理：甲醇回流，再上中性氧化铝柱（100-200目，直径1.5cm，3.5g），先用甲醇洗脱，5%氢氧化钠洗脱，收集盐酸调Ph1-2，***萃取。
王劲，李洁，马彦，田佩瑶，彭国克采用HPLC法测定中药消毒产品中大黄酚和大黄素的含量。色谱条件：天津特纳Kromasil C18(200mm×4.6mm i.d.，7μ)色谱柱，流动相：φ=0．02mol／L KH2PO4水溶液(H3PO4调pH=3.5)／甲醇=15／85，柱温：室温，流速：1.0mL／min，紫外检测波长：260nm。仪器：美国Waters公司2695高效液相色谱仪(996二极管阵列检测器，MiUennium32色谱管理系统)。
HPLC法同时测定大黄素和大黄酚的含量时，文献报道所采用的色谱条件多为药典所载的条件。流动相为甲醇-磷酸系统，另外还有乙腈-磷酸系统、甲醇-水系统、甲醇-高氯酸系统、甲醇-冰醋酸系统等；检测波长多为254nm，也有采用430、440、438、287nm。也有以甲醇-水-异丙醇(80：10：10)磷酸调pH值为3.0，检测波长：439nm。样品处理方面一般用适当溶剂回流提取，除去溶剂后氧化水解，再以有机溶剂萃取。酸溶液多为盐酸和硫酸。

⑷ 大黄酸含量测定
方法1：仪器：Waters液相色谱仪，M411紫外检测器，M510输液泵，C-R6A数据处理机，U-6K手动进样器。色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，10μm(4.6×250mm)；流动相：甲醇-水-醋酸(83：17：0.2)；流速：1.0mL／min；检测波长：254nm。
方法2：岛津LC-10ATHPLC泵；Shim-pack ODS柱(150mm×4.6mm)；C-R7AC数据处理仪；SPD-IOA紫外可见检测器(以上均为日本生产)；l0μL LNEVADA微量进样器(美国生产)，10％甲醇乙腈-0.2％磷酸溶液(46：54)为流动相，流速lmL／min，检测波长258nm，柱温40℃。
方法3：日本岛津4C-4A高效液相色谱仪，SPD-6AV紫外可见检测器，C-RJA数据处理器。流动相：甲醇-0.1mol/L磷酸水溶液（95：15），流速：1.0ml/min检测波长254nm。
方法4：仪器：大连依利特高效液相色谱仪；P200 II高压恒流泵；UV200 II紫外可变波长检测器；色谱柱：HYDERSIR BDS C18分析柱(5μm，200nm × 4.6nm)；柱温：室温；流动相：甲醇-水-异丙醇(80：10：10)磷酸调PH值为3.0。流速：0.6ml／min：检测波长：439nm：
样品的前处理上根据大黄酸以及制剂的性质具体考虑，一般多用两种方法：甲醇或氯仿超声或索氏提取或提它提取方法提取，过滤或离心操作，取清夜进样；用不同浓度的盐酸或硫酸水解不同时间，再用氯仿萃取，取清夜进样。

二 薄层扫描法
文献报道最多的是使用薄层扫描法来测定大黄素的含量。常用的是双波长扫描法。
展开系统使用较多的有：正己烷-醋酸乙酯-甲酸、苯-乙酸乙酯-甲酸、氯仿-甲醇-苯、石油醚(30～60℃)-甲酸乙酯-甲酸、环己烷-乙酸乙酯-甲酸等。
双波长扫描波长：λs=440nm, λR=600nm；λs=290nm, λR=312nm；λs=447nm, λR=550nm；λs=450nm, λR=700nm等。一般测定波长在400-450nm之间，参比波长在450-700nm之间。单波长扫描时，大黄素450nm、420 nm等，大黄素甲醚443nm、435nm等。

三、极谱法
文献报道的采用极谱法一般测定大黄酸的含量。
方法1：仪器：JP3-l型极谱仪(山东电讯七厂)，XJP-821(B)型新极谱仪(中科院长春应化所，江苏电分析仪器厂)；DME为工作电极，参比电极为饱和甘汞电极，辅助电极为铂丝。以H3B03-Na2B407(PH=9.O0)为底液。起始电位为-0．40V
方法2：JP303线性扫描极谱仪(成都仪器厂)，滴汞、饱和甘汞、铂丝三电极体系。以pH=4．74的0.2molNaAC-HAC为底液。起扫电位为-100 mV。

四、毛细管电泳电化学方法(CE-ED)
文献报道的采用毛细管电泳电化学方法一般测定大黄酸的含量。
方法：仪器：毛细管电泳双通道电化学柱端检测装置：高压电源( PN10／MCN22，美国High Voltage Elec-tronies Corporation)；DF-86A伏安仪(登峰电子仪器厂，氧化在正区，还原在负区)；多通道毛细管电泳数据工作站(中山大学电分析室)；CHI600A电化学工作站(上海辰华仪器公司)；石英毛细管柱(25∽150／μm i．d．)(河北永年光导纤维厂)；碳糊电极(自制，采用150／μm i．d．的毛细管作为外套管，内填充质量比为60：40的光谱纯炭粉和石蜡油混合物)，金属圆盘工作电极(自制，采用150／μm i．d．的毛细管作为外套管，内穿人100／μm i．d．的铂丝或金丝)，饱和甘汞电极(SCE)(江苏电分析仪器厂)，铂片辅助电极(上海电光器件厂)。
近年来，薄层扫描法和高效液相色谱法大黄含量测定的报道较多，极谱法和毛细管电泳电化学法报道较少，但相比之下，极谱法和毛细管电泳电化学法可以获得更多的样品信息，而且扩大了大黄及其制剂的质控方法。

五、比色法
因该方法操作麻烦，重现性差，以逐步被淘汰，这里不做介绍。