中药质量评价的新技术－指纹图谱

　　质量稳定的原料是生产质量稳定产品的先决条件。因此，中药材的质量直接关系到中药提取物及中成药的质量。中药已有上千年应用的实践。但如何有效准确地评价中药的质量，如何保证中药的疗效是一个越来越需要迫切解决的问题。
指纹图谱是指栽种(或某产地)中药材中成药中的共有的、特征性的某类或数类成分的色谱或光谱的图谱。
世界公认，中药化学成分的多样性与复杂性是其疗效的物质基础，同时也是质量评价的重点与难点。在现有研究手段和条件下，由于中医药理论与现代医学的差异，使得阐明中药的有效成分是一项极为困难的研究课题，无论是代表中药现代研究结果的青篙素、靛玉红，还是人工合成的人工牛黄和麝香酮，均不能代表原有中药的全部功效。相比而言，系统分析中药的化学成分，阐明有效部位或有效成分种类是可行的。中药药效既然不能为一个或一种化学成分所体现，那么，建立全面反映所含成分的指纹图谱，将更加有效地体现中药成分的复杂性，从而更好地评价中药的质量，中药指纹图谱必将成为中药质量评价一种有效方法。同时指纹图谱也为国际社会所认可，将有利于中药及其产品进入国际市场。中药指纹图谱的建立，应以系统的化学成分研究和药理学研究为依托，应体现系统性、特征性、稳定性三个基本原则。
系统性指的是指纹图谱所反映的化学成分，应包括中药有效部位所含大部分成分的种类，或指标成分的全部。如中药人参中所含的有效成分多为皂贰类化合物，则其指纹谱应尽可能多地反映其中的皂贰成分；银杏叶的有效成分是黄酮和银杏内酯类，则其指纹谱可采用两种方法，针对这两类成分分别分析，以达到系统全面的目的。特征性是指指纹图谱中反映的化学成分信息(具体表现为保留时间或比移值)是具有高度选择性的，这些信息的综合结果，将能特征地区分中药的真伪与优劣，成为中药自身的“化学条码”。如北五昧子的HPLC指纹图谱和TLC指纹图谱，不仅包括多种己知的五昧子木脂素类成分，而是还有许多未知成分，这些成分之间的顺序、比值在一定范围内是固定的，并是随药材品种不同，通过这些整体信息，可以很好地区分北五昧子与南五昧子，以及其它来源的五昧子药材，判别药材的真伪与优劣。
稳定性指的是所建立的指纹图谱，在规定的方法与条件下，不同的操作者和不同的实验室应能作出相同的指纹图谱，其误差应在允许的范围内，这样才可以保证指纹图谱的使用具有通用性和实用性，也是作为标准方法所必备的特征之一。实现指纹图谱的稳定性，除在样品制备方法、分析过程、结果处理等环节规范操作外，还应建立相应的评价机构，对指纹图谱进行客观评价，并公布标准指纹增。实现中药指纹图谱的三原则，保证其标准化，做到统一规范，这样才可以使用中药指纹图谱得以推广应用。
1注射剂用中药材指纹图谱技术的要求
中药材指纹图谱系指中药材经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示该中药材特性的共有峰的图谱。如原药材需经过特殊炮制(如醋制、酒制、炒炭等)，则应制定原药材和炮制品指纹图谱的检测标准。
1．1指纹图谱的检测标准 包括名称、汉语拼音、拉丁名、来源、供试品和参照物的制备、检测方法、指纹图谱及技术参数。有关项目的技术要求如下：
1．1．1名称、汉语拼音按中药命名原则制定。
1．1．2来源 包括原植、动物的学名、中文名、拉丁学名、药用部位、产地、采收季节、产地加工、炮制方法等。矿物药包括矿物的类、族、矿石名或岩石名、主要成分、产地、产地加工、炮制方法等。动、植物药材均应固定品种、药用部位、产地，采收期、产地加工和炮制方法。矿物药也应固定产地和炮制、加工方法。供试品的取样参照《中国药典》2000年版中规定的中药材的取样方法，以保证供试品的代表性和均一性。
1.1．3供试品的制备 应根据中药材中所含化学成分的理化性质和检测方法的需要，选择适宜的方法进行制备。制备方法必须确保该中药材的主要化学成分在指纹图谱中的体现。对于仅提取其中某类或数类成分的中药材，除按化学成分的性质提取各类成分制定指纹图谱外，还需按注射剂制备工艺制备供试品，制定指纹图谱，用以分析中药材与注射剂指纹图谱的相关性。
1．1．4参照物的制备 制定指纹图谱必须设立参照物，应根据供试品中所含成分的性质，选择适宜的对照品作为参照物，如果没有适宜的对照品，可选择适宜的内标物作为参照物。参照物的制备应根据检测方法的需要，选择适宜的方法进行。
1．1．5测定方法 包括测定方法、仪器、试剂、测定条件等。应根据中药材所含化学成分的理化性质，选择适宜的测定方法。建议优先考虑色谱方法。对于成分复杂的中药材，必要时可以考虑采用多种测定方法，建立多张指纹图谱。以色谱方法制定指纹图谱所采用的色谱柱、薄层板、试剂、测定条件等必须固定：以光谱方法制定指纹图谱，相应的测定条件也必须固定。
1．1.6指纹图谱及技术参数
1.1．6．1指纹图谱 根据供试品的检测结果，建立指纹图谱。采用高效液相色谱法和气相色谱法制定指绞图谱，其指纹图谱的记录时间一般为1h；采用薄层扫描法制定指纹图谱，必须提供从原点至溶剂前沿的图谱：采用光谱方法制定指纹图谱，必须按各种光谱的相应规定提供全谱，对于化学成分类型复杂品种，必要时可建立多张指纹图谱。
指纹图谱的建立：根据10批次以上供试品的检测结果所给出的相关参数，制定指纹图谱。
1．1．6．2共有指纹峰的标定 采用色谱方法制定指纹图谱，必须根据参照物的保留时间，计算指纹峰的相对保留时间，根据10批次以上供试品的检测结果，标定中药材的共有指纹峰。色谱法采用相对保留时间标定指纹峰，光谱法采用波长或波数标定指纹峰。
1．1．6．3共有指纹峰面积的比值 以对照品作为参照物的指纹图谱，以参照物峰面积作为1，计算各共有指纹峰面积与参照物峰面积的比值：以内标物作为参照物的指纹图谱，则以共有指纹峰中其中一个峰(要求峰面积相对较大、较稳定的共有峰)的峰面积作为1，计算其它各共有指纹峰面积的比值。各共有指纹峰的面积比值必须相对固定。中药材的供试品图谱中各共有峰面积的比值与指纹图谱各共有峰面积的比值比较，单峰面积占总峰面积大于或等于20％的共有峰，其差值不得大于土20％；单峰面积占总峰面积大于或等于10％，而小于20％的共有峰，其差值不得大于i25％：单峰面积占总峰面积小于10％的共有峰，峰面积比值不作要求，但必须标定相对保留时间，未达基线分离的共有峰，应计算该组峰的总峰面积作为峰面积，同时标定该组各峰的相对保留时间。
1．1．6‘4非共有峰面积 中药材供试品的图谱与指纹图谱比较，非共有峰总面积不得大于总峰面积的10％。
1、2起草说明 目的在于说明制定指纹图谱检测标准中各个项目的理由，规定各项目指标的依据、技术条件和注意事项等，既要有理论解释，又要有实践工作的总结及试验数据。具体要求如下：
1．2，1名称、汉语拼音阐明确定该名称的理由与依据。
1．2．2来源
1．2．2．1对于多来源的中药材，必须固定单一品种。对于多药用部位的中药材，必须固定单一药用部位。已有国家标准(包括药典和部颁标准)的中药材，应引用国家标准：已有地方标准的中药材，除引用地方标准外，必须附标准的复印件。
1．2．2．2注射剂用中药材一般固定一个产地，如固定多个产地，需制定各产地中药材的指纹图谱。
1，2．2、3注射剂用中药材一般固定一个采收期，如固定多个采收期，需制定各采收期中药材的指纹图谱。
1．2．2．4在注射剂申报中，鼓励建立中药材规范化栽培基地或选用已有的规范化栽培基地生产的中药材。
1．2．2．5中药材的炮制必须固定一种方法。并制订严格的炮制技术标准操作规范，应根据《中药材炮制加工规范》进行详细叙述。
1．2．3供试品的制备 应说明选用制备方法的依据。如供试品需要提取、纯化，应考察提取溶剂、提取方法，纯化方法等，提取、纯化方法应力求最大限度地保留供试品中的化学成分；如供试品需要粉碎检测，应考察粉碎方法、拉度等。
1．2．4参照物的制各应说明参照物的选择和试验样品制备的依据。应根据供试品中所含成分的性质，选择适宜的对照品或内标物作为参照物。参照物的制备应根据检测方法的需要，选择适宜的方法进行，并说明制各理由。
1．2．5根据供试品的特点和所含化学成分的理化性质选择相应的检测方法。应说明选择检测方法的依据和该检测方法的原理，确定该检测方法的方法学考察资料和相关图谱(包括稳定性、精密度和重现性)。对于所含成分类型较多的中药材，如一种检测方法或一张图谱不能反映该中药材的固有特性，可以考虑采用多种检测方法或一种检测方法的多种测定条件，建立多张指纹图谱。建立指纹图谱所采用的色谱柱、薄层板等必须固定厂家和型号、规格、试剂、测定条件等也必须相应固定。采用光谱法建立指纹图谱，其相应的检测条件也必须固定。
稳定性试验：主要考察供试品的稳定性。取同一供试品，分别在不同时间检测，考察色谱峰的相对保留时间，峰面积比值的一致性，确定检测时间，采用光谱方法检测的供试品，参照色谱方法进行相应考察。
精密度试验：主要考察仪器的精密度。取同一供试品，连续进样5次以上，考察色谱峰的相对保留时间、峰面积的一致性。采用高效液相色谱和气相色谱制定指纹图谱，在指纹图谱中规定共有峰面积比值的各色谱峰，其峰面积比值的相对标淮偏差RSD不得大于3％，其它方法不得大于5％。采用光谱方法检测的供试品，参照色谱方法进行相应考察，相对标堆偏差贴D不得大于3％。
重现性试验：主要考察实验方法的重现性。取同一批号的供试品5份以上，按照供试品的制备和检测方法制备供试品并进行检测，考察色谱峰的相对保留时间、峰面积比值的一致性。采用高效液相色谱和气相色谱制定指纹图谱，在指纹图谱中规定共有峰面积比值的各色谱峰，其峰面积比值的相对标准偏差贴D不得大于3％，其它方法不得大于5％。采用光谱方法检测的供试品，参照色谱方法进行相应考察，相对标准偏差贴D不得大于3％。
1．2、6指纹图谱及技术参数
1．2．6．1指纹图谱 根据供试品的检测结果制定指纹图谱，采用阿拉伯数字标示共有峰，用、’S’标示参照物的峰。采用高效液相色谱法和气相色谱法制定指纹图谱，应提供2h时的记录图，以考察1h以后的色谱峰情况。
提供建立指纹图谱的有关数据，包括各共有峰的相对保留时间、各共有峰面积的比值。采用光谱方法建立的指纹图谱，也必须提供相应的数据。
1．2．6．2共有指纹峰的标定 应根据10批次以上供试品的检测结果，标定中药材的共有指纹峰。说明标定共有峰的理由，并附各批供试品的图谱。
1．2．6．3共有指纹峰面积的比值 应根据10批次以上供试品图谱中各共有指纹峰面积的比值，计算平均比值，列出各批供试品的检测数据。
1．2．6．4非共有峰面积 计算10批次以上供试品图谱中非共有峰总面积及占总峰面积的百分比，列出各批供试品的检测数据。
1。2。7注射剂用中药材指纹图谱检测标准(草案)
写格式
1．2。7．1中药材的名称、来源
1．2．7．2供试品的制备
1．2．7．3对照品溶液或内标物溶液的制备
1。2。7．4测定方法(包括仪器、试剂、测定条件和测定方法)
l。2．7．5指纹图谱及各项技术参数
1．2．7．6起草说明
2中药注射剂及其有效部位或中间体指纹图谱的检测标准
中药注射剂指纹图谱系指中药注射剂经适当处理后，采用一定的分析手段，得到能够标示该注射剂特性的共有峰的图谱。以有效部位或中间体投料的中药注射剂，还需制定有效部位或中间体的指纹图谱。
2．1指纹图谱的检测标准 包括供试品和参照物的制备、检测方法、指纹图谱及技术参数，有关项目的技术要求如下：
2．2供试品的制备 应根据注射剂、有效部位或中间体中所含化学成分的理化性质和检测方法的需要，选择适宜的方法进行制备。制备方法必须确保该注射剂、有效部位或中间体主要化学成分在指纹图谱中的再现。
2．1。2参照物的制备：参见中药材部分
2．1．3测定方法：参见中药材部分
2．1．4指纹图谱及技术参数：
2．1．4．1指纹图谱：参见中药材部分
2．1．4．2共有指纹峰的标定：参见中药材部分
2．1．4．3共有指纹峰面积的比值 以对照品作为参照物的指纹图谱，以参照物峰面积作为1，计算各共有指纹峰面积与参照物峰面积的比值：以内标物作为参照物的指纹图谱，则以共有指纹峰中其中一峰(要求峰面积相对较大、较稳定的共有峰)的峰面积作为1，计算其他各共有指纹峰面积的比值。各共有指纹峰的面积比值必须相对固定。供试品图谱中各共有峰面积的比值与指纹图谱中各共有峰面积的比值比较p保留时间小于或等于3hIu9的共有峰：
单峰面积占总峰面积大于或等于20％的共有峰，其差值不得大于土20％：单峰面积占总峰面积　　　　大于或等于10％，而小于20％的共有峰，其差值不得大于土25％：单峰面积占总峰面积大于或等于5％，而小于10％的共有峰，其差值不得大于土30％：单峰面积占总峰面积大于5％的共有峰，峰面积比值不作要求，但必须标定相对保留时间。保留时间超过30min的共有峰：单峰面积占总峰面积大于或等于l0％的共有峰，按上述规定执行：单峰面积占总峰面积小于10％的共有峰，峰面积比值不作要求，但必须标定相对保留时间。末达基线分离的共有峰，应计算该组峰的总峰面积作为峰面积p同时标定该组各峰的相对保留时间。以光谱方法制定指纹图谱，参照色谱方法的相应要求执行。
2．1．4．4非共有峰面积 供试品图谱与指纹图谱比较，非共有峰总面积不得大于总峰面积的5％。
2．1．4．5中药材、有效部位、中间体和注射剂指纹图
谱之间的相关性 为了确保制备工艺的科学性和稳定性，应根据中药材、有效部位、中间体和注射剂的指纹图谱，标定各图谱之间的相关性。
2．2起草说明
2．2．1供试品的制备：参见中药材部分
2．2．2参照物的制备：参见中药材部分
2．2．3检测方法：参见中药材部分
2．2．4指纹图谱及技术参数
2．2．4．1—2．2．4．4参见中药材部分
2．2．4．5中药材、有效部位、中间体和注射剂指纹图谱之间的相关性 应根据中药材、有效部位、中间体和注射剂的指纹图谱，标定各指纹图谱之间的相关性。必要时可采用加入菜一中药材、有效部位或中间体的供试品或制备菜一中药材、有效部位或中间体阴性供试品的方法标定各指纹图谱之间的相关性。提供相关性研究的指纹图谱。
2．2．4．6中试产品的指纹图谱 申报临床的中药注射剂必须提供三批以上中试产品的指纹图谱，申报生产的中药注射剂必须提供十批以上中试产品的指纹图谱。
2．2．5指纹图谱检测标准(草案)书写格式
2．2．5．1供试品的制备
2．2．5．2对照品溶液或内标物溶液的制备
2．2．5．3测定方法(包括仪器、试剂、测定条件和测定方法)
2．2．5．4指纹图谱及各项技术参数
2．2．5．5起草说明
2．2．5．6有效部位或中间体的指纹图谱检测标准及起草说明
3中药指纹谱建立所面临的问题与对策
中药指纹谱图的建立，在技术上是完全可行的，但是在实际应用中，还面临许多问题，如中药来源品种的混乱、无序；产地、采制、加工方法的差异；基础研究的片面化，低水平重复等现象的存在，严重制约中药指纹图谱的建立与推行。只有加强中药种植与加工的规范化、中药化学成分研究的系统化与标准化、中药药理研究的规范化等中药生产、流通和研究
领域的标准化进程，才能保证中药质量的稳定，也才能保证中药指纹图谱建立的可行。技术上实现中药指纹图谱的建立，还需要结合现代分析技术手段。针对中药指纹图谱的研究，所涉及的方法种类繁多，包括TLC、TLCS、HPLC、HPLC/MS、GC、GC／MS、HPCE、IR、NMR以及x—射线衍射等，其中，色谱学方法是主流方法，尤其是TLC、HPLC和GC色谱技术，已经为大家所公认的三种常规的分析手段，随着科学技术的发展，色谱分析仪器的完善与提高，使得无论是薄层色谱还是高效液相色谱，在克服自身固有的缺陷，发挥自身优势方面有了长足的发展，成为三种互相补充，相互结合的分析手段，其中HPLC方法随着新的高效通用型检测器的发展，如ELSD、ESIMS、MS／MS等设备的引入，使得HPLC的适用性与灵敏度得到显著提高，从而使复杂样品的成功分析成为可能。这些新设备新技术的应用，将使中药及其制剂指纹图谱的建立更加有效。
4结语
实现中药的现代化已经成为国家的重要目标，加强中药品质评价的现代化与标准化是其中的重要内容，指纹谱图将是完成这一内容的重要技术。中药指纹图谱的建立，不是一个或几个实验室就可以完成的研究课题，需要中药生产、流通、临床及研究等领域的广泛参与，只有协同合作，才可以保证中药指纹图谱具有系统、特征及稳定的特性，同时也将保证中药指纹图谱的广泛性与实用性，一个规范标准的指纹图谱将会有力地推动中药的现代化进程。