蛋白质固体表面荧光分析法研究

摘 要：本文以滤纸为基质研究曙红Y与牛血清蛋(BSA)白作用，建立了蛋白质的固体表面荧光分析法。实验证明，本方法具有操作简便、灵敏度高(检出限0.15mg/L)、线性范围宽(0.15～50 mg/L)、取样量少(6μL／spot)等特点，对合成样品中的牛血清蛋白(BSA)测定结果令人满意。
关键词：曙红Y；牛血清蛋白；滤纸；固体表面荧光
蛋白质定量分析是化学和生物学的一个重要方面。目前，蛋白质含量的测定方法很多，常用分析方法有色谱法、光谱法等。固体表面荧光分析法(SSF)是一种微量技术与痕量分析结合的测试技术，具有取样量少、灵敏度高、线性范围宽、操作简便、快速等优点，适用于生化及药物分析，已用于中草药有效成分含量分析、硫化氢气体检测等，而利用固体表面荧光分析蛋白质未见报道。本文在研究曙红Y与牛血清蛋白(BSA)作用的基础上，以滤纸为基质研究曙红Y与BSA的作用，建立了蛋白质的固体表面荧光分析法，本方法具有操作简便、灵敏度高、线性范围宽、取样量少等优点，用于合成样品中BSA测定，分析结果令人满意。
1 实验部分
1．1 仪器与试剂
RF-540型荧光分光光度计，附固体样品架(日本，岛津)；pHB-4型酸度计(上海雷磁仪器厂)；5μL、10μL无存液微量进样器；快速、中速、慢速定性滤纸，快速、中速、慢速定量滤纸(杭州新华纸业有限公司)。牛血清蛋白(BSA，中国科学院化学研究所)：相对分子质量按65000计，以50g/L NaC1水溶液配成100 mg／L，使用时稀释；曙红Y溶液：1×10-4mol/L；HC1溶液：0.2mol/L。所用试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。
1．2 实验方法
在一系列比色管中分别加入1.0mL 1×10-4mol/L曙红Y溶液、一定量BSA以及HC1溶液并摇匀，控制pH 4.2。滤纸裁成15×30 mm的矩形，在相应于光斑的位置刻两条间距2mm，长20mm平行线，记录点样位置。用10μL无存液微量进样器取6μL溶液滴加在点样位置，放置5min，覆盖石英片，置于固体样品架上，用308nm波长光激发，在波长540nm处测定发射光强度，同时作试剂空白实验。
2 结果与讨论
2．1 曙红Y的激发光谱与发射光谱
在pH 4.2的溶液中，曙红Y最大激发波长为308nm，最大发射波长是540nm，当加入BSA后荧光猝灭，其猝灭程度与BSA浓度成正比，据此拟定牛血清蛋白的分析方法。
2．2 滤纸的选择
考察曙红Y在不同的滤纸基质上的激发与发射光谱，结果表明，基质对激发和发射波长没有影响，荧光强度在滤纸上较强，尤以慢速定量滤纸上的强度最高，且背景很低。本文选择慢速定量滤纸作为适宜的基质。
2．3 反应时间的影响
曙红Y与BSA反应很快，于室温下5min反应完全，3h内荧光强度不变。
2．4 反应酸度的影响
实验表明酸度对体系的影响很大，随着酸度的增加，体系的荧光猝灭较大。当溶液的pH值为4.2时体系荧光强度最大且比较稳定。实验选择溶液的pH值为4.2。
2．5 曙红Y加入量的影响
试验了曙红Y加入量的影响，当曙红Y的浓度在1×10-6mol/L至1×10-4mol/L 范围内时，荧光强度较大，选择加入1×10-5mol/L 曙红Y的量为1.0 mL，此时荧光强度最大。
2．6 离子强度的影响
用NaCl的加入量来试验离子强度的影响，结果表明0.1 mol/LnaCl的加入量在2.0mL以内，对体系的荧光强度无影响，超过2.0 mL以后，对体系的影响较大。
2．7 干扰物质的影响
测定10μg/mLBSA 时，Co2+、Fe2+、Cr3+、Ni3+、Pb2+(10倍)，Cu2+、Ca2+、Zn2+、Mg2+(2O倍)，K+、Na+(50倍)，柠檬酸、葡萄糖、氨基酸(10倍)不干扰测定(相对标准偏差≤±5.0 )。说明本方法有较高的选择性。当Fe3+的浓度超过BSA的浓度的20倍时有干扰，此时可将Fe3+件还原为Fe2+。
2．8 分析性能
按照实验方法，绘制了测定蛋白质的工作曲线，曲线的线性范围为0.15～50mg/L，线性方程为F=17.98-2.13c，相关系数为0.9996，检出限为0.15mg/L，对3Omg/mLBSA 11次测定的平均结果为29.58 mg/L，相对标准偏差≤±1.4%，说明本方法准确可靠。
2．9 合成样品分析
按照本文方法和溴甲酚绿法(BCG)对合成样品中的BSA进行测定。