分离时选择了合适的蛋白柱，有时往往不能成功地完成蛋白的分离，同一根蛋白分离柱在不同的使用者手中可能会有不同的柱寿命及分离效果，正确的使用蛋白柱和正确的日常维护是保证成功分离蛋白及延长柱寿命的关键。
不论使用什么类型的蛋白柱，首先必须对其填料的性能有基本了解。如该柱适用什么样的溶剂，什么类型的样品，流速及耐压范围等，GAT提供的各种类型的蛋白柱，在柱箱内均有详细的说明书，使用柱子前，务必要仔细阅读，以保证正确使用这些柱子。下面就蛋白分离中常出现的问题进行讨论。
①样品不保留：
在用离子交换柱分离蛋白时，流动相的pH值对保留值影响很大，当选用阴离子型蛋白分析柱时，如#####若流动相的pH值小于蛋白的pI值时，蛋白分子阳离子状态，则在柱上没有保留，只有当流动相的pH值大于蛋白的pI值时，蛋白分子呈阴离子，才能在阴离子交换柱上得到保留。另外，当流动相或样品中的离子强度过大时，也会造成蛋白在离子交换柱上不保留。
此外，上样量过大，亦会使蛋白样品保留变弱，一般样品的上样量不应超过该填料结合蛋白量的20%，在选用GPC柱时，应特别注意填料的孔径及相应的可分离蛋白的分子量范围，若蛋白的分子量超过填料的孔径极限则蛋白样品也不保留。
在用反相色谱分离蛋白时，流动相中有机溶剂的比例会影响蛋白的保留值。有机溶剂比例过高，会使蛋白的样品与填料的作用变弱而过早地洗脱。流动相中的三氟乙酸可作为离子对试剂和pH调节剂，有利于蛋白的保留。
②回收率（质量回收率）低
蛋白质量回收率低往往发生在使用凝胶过滤柱时，特别是以硅胶为基质的凝胶蛋白分析柱时，尽管硅醇基已经过双醇封口，但残留的硅醇基仍会与蛋白的碱性基团发生非GFC效应，造成回收率低，分离度差等现象,解决这一现象的方法是在流动相（通常是水）中加入0。M-0。3M盐作为改性剂以减少这种非GFC效应。
③柱压过高
柱压过高的原因在于柱入口的堵塞及填料间的缝隙的减小或堵死，这些原因有：非硅胶填料的颗粒膨胀（主要是由于使用过高比例有机溶剂引起）；来自样品，流动相的颗粒堵塞、细菌生长，流速过高等，为防止柱压过高，应使用符合要求的流动相组成。样品，流动相使用前严格过滤。为了保存时防止细菌生长。以硅胶为基质的柱子可使用20%有机水溶液保存。其它柱子在保存液中加入0。02%的叠氨钠。
④性能改变
蛋白柱在使用一段时间后，其性能会有所改变（保留值变化，柱效下降等）。原因之一是被分离样品中细胞碎片，类脂，酸等的污染，对聚合物基质的柱子可用0。1-1。0N NaOH溶液清洗，注意以硅胶为基质的柱子（如Protein Pak凝胶柱）不能用NaOH清洗。