鸡新城疫（ND）、传染性支气管炎（IB）和传染性法氏囊病（IBD）三种传染病通常采用相应的单苗进行多次免疫，不仅费工费时，频繁免疫接种还会引起鸡的应激反应。目前，国外已研制出鸡新城疫、传染性支气管炎和传染性法氏囊三联弱毒疫苗。近年来，国内也开展了这方面的研究工作，由于各地采用的毒株不同，制备工艺不同，病毒的培养方式也不一样，制备的鸡新城疫-传染性支气管炎-传染性法氏囊三联疫苗对鸡的免疫效果也不一样。
笔者采用鸡胚尿囊腔同胚培养新城疫Lasota株和传染性支气管炎H120株，鸡胚成纤维细胞旋转立体培养传染性法氏囊B87，将收获的含毒鸡胚尿囊液和细胞毒液通过配制比例筛选混合冻干，制备成鸡新城疫-传染性支气管炎-传染性法氏囊三联弱毒冻干疫苗，为了了解该疫苗的各项性能，特进行了疫苗的检测试验。
一、材料与方法
（一）材料
鸡新城疫-传染性支气管炎-传染性法氏囊三联弱毒冻干疫苗、硫乙醇酸盐培养基（T.G）、酪胨琼脂（G.A）、改良Frey培养基，由本课题组制备。
新城疫F48E9强毒、传染性支气管炎M41强毒和传染性法氏囊BC6-85强毒，购自中国兽医药品监察所。
14日龄非免疫雏鸡由本所实验鸡场提供。
（二）检测方法
物理性状观察 疫苗经冻干后，观察其颜色、疏松度，是否能与瓶壁脱落，加稀释液后的溶解度如何。
无菌检验每批冻干疫苗随机抽取4支，用灭菌生理盐水稀释至原量，混合后接种硫乙醇酸盐培养基（T.G）小管及酪胨琼脂（G.A）斜面各2支，每支0.2毫升，一支置36±1℃培养；一支置25±1℃培养，另设生理盐水和空白对照管，观察3~5天。
支原体检验每批冻干疫苗随机抽取4支，用灭菌生理盐水稀释至原量，混合后将5毫升疫苗混合物接种于小瓶改良Frey培养基，再从小瓶中取0.2毫升移植接种于1小管液体培养基内，将小瓶与小管同时37℃培养，每日观察培养物颜色变化。若在5~7天尚未见变化，再从小瓶中取0.2毫升移植于另1管液体培养基内，置37℃继续培养观察5~7天，如此重复3次，若无变化，在最后一次接种小管的培养物观察14天后停止观察。
倘若在观察期内，如果发现小瓶或任何一支小管培养物颜色出现明显变化，pH值变化达±0.5时，应立即移植于小管液体培养基和固体培养基上，观察在液体培养基中是否出现恒定的pH变化，及固体培养基上有无典型的“煎蛋”状支原体菌落。
剩余水分含量测定采用真空烘干法，测定前，先将洗净干燥的称量瓶，置150℃干燥箱烘干2小时，放氯化钙罐中冷却后称重。迅速打开真空良好的疫苗瓶，将制品倒入称量瓶内盖好，在天平上称量。每批做4个样品，立即将称量瓶置于有P2O5的真空干燥箱中，打开瓶盖，抽真空（133.322~666.61Pa）加热（60~70℃）干燥3小时。然后通入经过氯化钙吸水的干燥空气，待真空干燥箱温度稍下降后，打开箱门，迅速盖好称量瓶盖，将所有称量瓶移入有氯化钙的干燥罐中，冷却至室温时称重，然后再移回到真空干燥箱内继续烘干3小时，两次烘干达到恒量，减失的重量即为含水量（每瓶制品的含水量不应超过4%）。
计算公式：含水量%=（样品干前重－样品干后重）/干前重×100
真空度检验 用高频火花真空测定器照射疫苗瓶，看是否出现紫色辉光。
安全性检验 每批疫苗随机抽取4支，稀释后充分混合，给30只14日龄雏鸡颈部皮下注射接种10个使用剂量，观察14天，看有无异常反应。
疫苗的效力检验新城疫效力检验：将14日龄的健康非免疫雏鸡20只，随机分为两组，每组10只，1组为对照组，不接种任何疫苗；2组为试验组，每只鸡滴鼻接种1个使用剂量的鸡新城疫-传染性支气管炎-传染性法氏囊三联弱毒冻干疫苗。分别在免疫前、免疫后7、14天翅静脉采血，用β-微量血凝抑制试验测定血清中新城疫的抗体水平。14天后将所有鸡用10000ELD50的新城疫F48E9强毒肌肉注射1毫升/只，观察10~14天，并计算免疫鸡的保护率和未免疫对照鸡的发病死亡率。
传染性支气管炎效力检验：将14日龄的健康非免疫雏鸡20只，随机分为两组，每组10只，1组为对照组，不接种疫苗，2组为试验组，每只鸡滴鼻接种1个使用剂量的鸡新城疫-传染性支气管炎-传染性法氏囊三联弱毒冻干疫苗。分别在免疫前、免疫后7、14天翅静脉采血，用β-微量血凝抑制试验测定血清中传染性支气管炎的抗体水平。14天后将所有鸡用10倍稀释的IBM41强毒滴鼻，每只鸡1~2滴，观察10~14天，并计算免疫鸡的保护率和未免疫对照鸡的发病死亡率。
传染性法氏囊效力检验：将14日龄的健康非免疫雏鸡20只，随机分为两组，每组10只，1组为对照组，不接种疫苗，2组为试验组，每只鸡滴鼻接种1个使用剂量的鸡新城疫-传染性支气管炎-传染性法氏囊三联弱毒冻干疫苗。分别在免疫前、免疫后7、14天翅静脉采血分离血清，用AGP法测定传染性法氏囊抗体阳性率，20天后取全部免疫鸡连同对照鸡，每只点眼攻击50个发病量的传染性法氏囊BC6-85强毒0.05毫升，72小时后剖杀所有鸡，检查法氏囊的变化。
疫苗的免疫期测定用20只14日龄的非免疫健康雏鸡，每只颈部皮下注射鸡新城疫-传染性支气管炎-传染性法氏囊三联弱毒冻干疫苗0.2毫升（含1个使用剂量），于免疫后第14天开始，每间隔14天用β-微量血凝抑制试验测定血清中新城疫、传染性支气管炎的抗体滴度，用AGP法测定传染性法氏囊抗体阳性率，直至血清抗体水平降至公认的保护抗体水平。
疫苗的保存期测定试制的鸡新城疫-传染性支气管炎-传染性法氏囊三联弱毒冻干疫苗经物理性状观察和实验室检验合格后，于－25℃冷冻保存；每间隔3个月免疫14日龄雏鸡10只，同时另设对照10只，于免疫后14天采血分离血清，检测鸡新城疫、传染性支气管炎、传染性法氏囊的抗体水平，确定该疫苗的保存期。
二、试验结果
物理性状观察 冻干后的疫苗均呈微红色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后能迅速溶解。
疫苗的无菌检验 经观察，接种疫苗的硫乙醇酸盐培养基（T.G）小管和酪胨琼脂（G.A）斜面小管及对照管在5天内均无细菌生长。
疫苗的支原体检验在3次7天的反复培养和最后一次14天的培养中，小瓶和小管内的培养基颜色均无变黄或变红的现象，说明试制的3批疫苗均无支原体污染。
疫苗的剩余水分含量测定从下表1可以看出，试制的3批鸡新城疫-传染性支气管炎-传染性法氏囊三联弱毒冻干疫苗剩余水分含量均未超过4%，合乎国标要求。
表1 鸡新城疫-传染性支气管炎-传染性法氏囊三联
弱毒冻干疫苗的剩余水分含量测定结果（%）
疫苗的真空度检查 用高频火花真空测定器测定，3批疫苗瓶内均出现紫色辉光，说明真空度检验合格。
疫苗的安全检验通过14天的观察，用10个使用剂量的鸡新城疫-传染性支气管炎-传染性法氏囊三联弱毒冻干疫苗免疫的30只雏鸡生长发育良好、精神状况、饮食欲等均无异常表现。
疫苗的效力检验新城疫效力检验：由下表2可见，对照组与试验组在试验前抗体水平差异不显著（P＞0.05），在试验后7、14天，对照组与试验组相比，抗体水平差异极显著（P＜0.01）。攻毒试验结果显示，试验组100%（10/10）保护，对照组100%（10/10）死亡。由此可见，用试制的鸡新城疫-传染性支气管炎-传染性法氏囊三联弱毒冻干疫苗1个使用剂量免疫接种14日龄雏鸡，7天可产生免疫力，免疫后14天对鸡新城疫强毒攻击的保护率为100%，说明该疫苗对预防雏鸡新城疫的发生是有效的。
表2 新城疫效力检验结果
传染性支气管炎效力检验：由表3可见，对照组与试验组在试验前抗体水平差异不显著（P＞0.05），在试验后7、14天，对照组与试验组相比，抗体水平差异极显著（P＜0.01）。攻毒试验结果显示，试验组100%（10/10）保护，对照组90%（9/10）死亡。由此可见，用试制的鸡新城疫-传染性支气管炎-传染性法氏囊三联弱毒冻干疫苗1个使用剂量免疫接种14日龄雏鸡，7天可产生免疫力，免疫后14天对鸡传染性支气管炎强毒攻击的保护率为100%。从而说明该疫苗对预防雏鸡传染性支气管炎的发生是有效的。
表3 传染性支气管炎效力检验结果
传染性法氏囊效力检验：由下表4可见，对照组与试验组在试验前传染性法氏囊的抗体阳性率差异不显著（P＞0.05），在试验后7、14天，对照组与试验组相比，抗体阳性率差异极显著（P＜0.01）。攻毒后72小时的剖检结果为，试验组10只鸡中7只法氏囊无任何肉眼可见变化，3只鸡的法氏囊有不同程度的病变，因而该疫苗的保护率为70%；而对照组10只鸡法氏囊全部不同程度的表现为：法氏囊体积和重量均增大，囊壁增厚，发黄，黏膜表面有点状出血或瘀血性出血，囊表面覆有一层胶胨样黄色渗出液，并有纵行条纹，囊腔内充满混浊粘液和干酪样渗出物，即100%发病。说明试制的鸡新城疫-传染性支气管炎-传染性法氏囊三联弱毒冻干疫苗对预防鸡传染性法氏囊的发生有较好的作用。
表4 传染性法氏囊效力检验结果（%）
疫苗免疫期测定由下表5可见，用三联弱毒冻干疫苗免疫14日龄小鸡后，14~28天抗体效价逐渐升高，42天后开始逐渐下降，至70天时仍可检测到较高水平的的抗体（或阳性率）。表明试制的鸡新城疫-传染性支气管炎-传染性法氏囊三联弱毒冻干疫苗的免疫期最少为60天。
表5 免疫期测定结果
疫苗保存期测定从下表6可见，试制的鸡新城疫-传染性支气管炎-传染性法氏囊三联弱毒冻干疫苗在-25℃保存1、4、7、9和12个月，免疫接种14日龄小鸡后14天产生的新城疫抗体效价分别为7.5、7.4、7.4、7.2和7.3；传染性支气管炎的抗体效价分别为7.3、7.4、7.2和7.0；传染性法氏囊抗体阳性率分别为80%、70%、80%、70%和70%，免疫力下降程度不大，差异不显著。因此，鸡新城疫-传染性支气管炎-传染性法氏囊D三联弱毒冻干疫苗在-25℃的保存期至少为1年。
表6 保存期测定
结果
三、结论
1.将新城疫Lasota、传染性支气管炎H120和传染性法氏囊B87三种抗原按一定比例配比制备的鸡三联弱毒冻干疫苗，在物理性状、无菌检验、支原体检验、剩余水分含量测定、真空度检验方面合格，符合《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》。
2.疫苗的安全检验直接关系到疫苗的应用，本试验使用10个使用剂量的鸡新城疫-传染性支气管炎-传染性法氏囊三联弱毒冻干疫苗免疫雏鸡，雏鸡在精神状况、饮食欲等均无异常表现，说明该疫苗在鸡上使用无毒力返强现象，对14日龄以上鸡无毒副作用，安全性好。
3.效力检验是验证疫苗应用效果的关键，本试验采用雏鸡检验疫苗的效力方法，对14日龄非免疫雏鸡注射鸡新城疫-传染性支气管炎-传染性法氏囊三联弱毒冻干疫苗后，在鸡体内能产生较高的抗体水平，抵抗新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和传染性法氏囊强毒的攻击，说明该疫苗的3种抗原在鸡体内均产生了较强的免疫应答反应，达到接种1次有效预防鸡新城疫、传染性支气管炎和传染性法氏囊三种传染病的发生。
免疫期测定结果表明，应用鸡新城疫-传染性支气管炎-传染性法氏囊三联弱毒冻干疫苗免疫14日龄雏鸡后，14~42天d抗体效价（或阳性率）高，免疫效果好。此后抗体效价（或阳性率）降低，免疫效果减弱，但仍具有一定保护力，免疫期限为60天左右。
4.制备的鸡新城疫-传染性支气管炎-传染性法氏囊三联弱毒冻干疫苗在-25℃下可保存12个月，免疫后产生的抗体水平（或阳性率）变化不大，因而认为其保存期限为12个月。
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