微生态制剂在水产养殖中的作用机理及应用研究进展

摘　要：介绍了微生态制剂在水产动物健康养殖中的作用机制，以及微生态制剂在刺参养殖中的应用前景。微生态制剂在水产动物中的作用机理包括通过竞争来抑制病原菌生长(如黏附位点、营养、能源等)、通过代谢物(如抑菌物质、消化酶等)调节微生态平衡、提高免疫机能、改善水质、群体感应(quorumsensing，QS)。刺参生理生化反应、生活习性的研究为刺参微生态制剂的开发奠定了基础，也存在一些问题限制了它在刺参养殖中的应用，但微生态制剂仍然是抗生素最有潜力的替代品，具有广阔的应用前景。

关键词：微生态制剂；益生菌；水产养殖；作用机理；刺参

随着水产养殖业的迅速发展，工厂化高密度养殖的规模日益扩大，养殖密度过大，养殖品种单一，养殖生态环境失调；未处理养殖废水、工业污水和生活污水的排放使近岸海水受到严重污染，造成养殖生态系的破坏，从而引发各种病害。为了防止水产动物病害的发生，抗生素和化学药物的应用起到了一定的积极作用。但长期使用也带来一系列副作用，许多有害微生物通过突变和质粒的基因调节对病原菌产生抗药性，导致抗生素用量的增加，引起内源性感染和二重感染；同时破坏和干扰了肠道正常菌群和养殖微生态环境，使水产动物产生免疫抑制作用；许多化学药物在水产动物体内积累，直接危害人类健康，大菱鲆药残事件已经给我们敲响了警钟。因此，水产养殖业必须走可持续发展的健康、生态养殖道路，使养殖的水产品成为无公害食品。

近年来，人们开始尝试在养殖过程中使用微生物类制剂(灭活细菌、疫苗、微生态制剂)来改善养殖生态环境，提高养殖动物的免疫力，以减少疾病的发生。接种疫苗可以有效地预防传染性疾病，但作用范围小、针对性强，对低等无脊椎动物作用有限。微生态制剂因绿色环保、无毒副作用、无残留污染、不产生抗性、无记忆性、作用范围广等优点成为抗生素最有潜力的替代品。

1　益生菌在水产动物中的作用机理

微生态制剂(Microecologics)通过加强肠道微生物区系的屏障作用或通过增进非特异性免疫功能，维持宿主微生态平衡，提高其健康水平，我们通常所说的益生菌即是狭义的微生态制剂。

水产养殖中有关益生菌的研究最初集中在幼鱼，目前多集中在鱼、虾、贝、甲壳类、活饵料生物等。在水产动物养殖中投喂益生菌，不仅能作用于水产动物的微生物菌群，还可以作用于水产动物的鳃、皮肤和周围的环境。在水产养殖中益生菌又被重新定义，通过改善宿主和周围环境的微生物菌群、提高饵料利用率、宿主免疫力、改善周围水质环境、对宿主产生有益影响的活的微生物。

益生菌在水产动物中的作用机理是建立在康白提出的动物微生态理论基础之上的，存在三个学说，即优势菌群学说，生物夺氧学说和菌群屏障学说，主要从以下五个方面对作用机理进行了阐述。

1.1　竞争性抑制

能否黏附是筛选益生菌的重要指标之一，鱼类通过皮肤、鳃、胃肠等途径感染病原菌，后者能否致病首先取决于它定植在这些组织的能力。有些益生菌对宿主皮肤黏膜上皮细胞的黏附可竞争性地抑制病原菌对易感细胞的黏附。从微生态平衡角度看，益生菌在机体黏膜的定植更有利于机体在内环境中形成一种生理性的、和谐而相对协调的平衡状态。

另外，益生菌和病原菌之间存在对化学物质、营养、可利用能量的争夺，据此来决定不同的菌群如何在同一个生态系统中共生。VerschuereL等报道了具有含铁细胞的益生菌和病原性依赖于含铁细胞的病原菌竞争铁离子，而抑制后者的存活。

1.2　通过代谢物调整微生态平衡

1.2.1　产生抑菌物质　益生菌分泌某些具杀菌或抑菌作用的物质(如有机酸、超氧化物歧化酶、过氧化氢、溶菌酶、细菌素等)，影响有害菌的定植和生长，反过来这些物质又影响宿主和有害菌对化学物质和能量的竞争，以此来调节机体的微生态平衡。许多从水产养殖环境、水产动物肠道分离的细菌体外可抑制已知的水产动物中出现的病原菌，但并未证实在体内条件下可产生这些抑菌物质。体外颉颃作用已经成为筛选益生菌的一个指标，用于体外检测待检菌是否对致病菌有颉颃作用，主要采用点种法、十字交叉法、平板扩散法。但要注意同一菌株在不同的实验条件下可能有不同的抑菌能力，因此不能根据体外抑菌作用来预测体内活力。

1.2.2　作为营养物质、产生消化酶，加强营养物质代谢、促进生长　肠道菌群直接影响宿主的营养状态，有关改变宿主肠道菌群来提高宿主生长和消化能力的研究越来越多。益生菌自身含有丰富的营养物质，还可在肠内合成多种维生素、氨基酸、蛋白质、促生长因子等，参与新陈代谢、加强营养物质代谢。酵母可以产生多胺类来促进肠道成熟，它已经被广泛添加到混合饲料中来饲养幼鱼。益生菌在体内还可产生多种消化酶，如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶，协助机体消化有机物质，提高饵料转化效率。芽孢杆菌的芽孢可产生多种酶类(淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶)及营养物质(多种氨基酸和维生素)。

1.3　提高免疫机能

益生菌可以刺激胸腺、脾脏等免疫器官的发育，有效提高抗干扰素和巨噬细胞的活性，通过产生抗体和提高噬菌作用活性等刺激免疫，增强T淋巴细胞和B淋巴细胞对抗原刺激的反应性，激发机体体液免疫和细胞免疫，从而增强机体免疫功能，对低等无脊椎动物而言主要是提高体液因子中的各种酶活力。目前，有关益生菌调节机体免疫功能机理的研究主要集中在蛋白质水平上，分析与天然免疫相关的酶以及克隆鉴定一些具有识别作用的分子，但有关分子机理的研究还有待进一步深入。Toll样受体(TLR)是一类与天然免疫密切相关的识别受体，因在机体的抗感染免疫和免疫调节方面有非常重要的作用而受关注。

关于益生菌作用于鱼类免疫系统的报道很多，杜远明等从正常鲤鱼肠道分离出节杆菌和乳杆菌来投喂鲢鱼，发现试验组白细胞吞噬率、吞噬指数、巨噬细胞吞噬率、成活率、特异性抗体效价均高于对照组。刘克琳等发现投喂益生菌后促进了鲤鱼免疫器官的成熟。张新明等发现细菌J-10添加到对虾饲料中可以提高凡纳滨对虾血清酚氧化酶活力(PO)、抗菌活力、溶菌活力、溶血素活性、SOD等。

1.4　改善水质

益生菌通过生物颉颃作用、生物絮凝作用、直接利用水体中的有机酸、氨、硫化氢等进行光合作用，并能转化铁、汞等有毒物质以及进行硝化和反硝化作用来改善水质。

芽孢杆菌(Bacillus)是目前常用的一种水质调节剂。李卓佳等对芽孢杆菌调控虾池微生态的机制进行了研究，表明它对水体异养细菌的生长有一定抑制作用，尤其能够明显抑制弧菌类群的繁殖生长，有效的预防虾病；对底泥异养细菌的生长和繁殖具有促进作用，有利于虾池环境的自我净化；对浮游微藻的平稳繁殖有促进作用，有助于营造和稳定虾池良性生态循环。

1.5　切断病原菌群体感应系统

群体感应(quorumsensing，QS)是细菌细胞和细胞之间信息交流的过程，在许多病原细菌(包括鱼类)的毒力调节因子中发现了QS的信号分子酰基高丝氨酸内酯(AHL)和呋喃酰硼酸二酯(AI-2)信号，QS系统能够调控微生物的多种生理生化功能如抗生素的合成、生物膜的形成和致病基因的表达等，破坏QS是一条抵抗水产动物病原菌入侵的新途径。

Manefield M和Rasch M等从海洋红藻Delisapulchra中提取出一种AHL类似物卤化呋喃，可以和细菌的AHL受体蛋白竞争性结合，用它伴饲投喂虹鳟可以抵抗弧菌病。因此，QS系统调控在农业、医学、环境保护等领域具有广阔的应用前景。但开发具有对QS破坏能力的益生菌还有许多问题有待解决。

2　微生态制剂在刺参养殖中的应用前景

目前，微生态制剂作用于鱼、虾等的报道很多，应用于刺参养殖的报道却不多。刺参(Apostichopusjaponicus)又称仿刺参，属棘皮动物门，刺参纲，仿刺参属。因其营养价值高，养殖规模不断扩大，目前已经发展成为我国沿海最大的海水养殖品种之一。近年来由于刺参高密度养殖和不规范运作以及病害防治技术的相对滞后，病害问题日趋突出，尤其养殖刺参“腐皮综合征”的暴发，造成了严重的经济损失，制约了该产业的持续健康发展。由于刺参特殊的生活习性和养殖特点，且抗生素药物和疫苗等疾病预防措施本身又存在一些限制性，故采用微生态制剂是防御刺参养殖疾病发生的有效措施之一。

2.1　刺参生理生化和养殖特点

目前有关微生态制剂在刺参养殖中应用的报道很少，有关刺参的细胞免疫、体液免疫、肠道菌群区系、防御感染机理的研究在国内外报道也甚少。

体腔细胞是棘皮类动物对病原防御的第一道防线，它的研究对刺参免疫学方面的深入研究有重要意义。Canicatti在Holothuriapolii体腔细胞中发现了一种溶菌酶样物质；Xing对玉足刺参(Holothurialeucospilota)体腔细胞进行了分类，并证实了具有吞噬染料、细菌等异物的功能；廖玉麟报道了海参体腔细胞的常见形式，淋巴细胞、吞噬细胞、无色桑椹细胞、纺锤细胞、血细胞，其中吞噬细胞具有吞噬其它细胞或物质的能力；常亚青对体腔细胞进行分类并且测定了体腔液中几种酶活力；刘洪伟、宋志东发现体液细胞在吞噬异物的同时产生活性氧(ROS)；熊川男等提出凝集素作为海参免疫增强剂，是防治海参病的一条有效途径。这些现象表明，刺参具有一定程度的细胞免疫和体液免疫作用。

目前对刺参肠道区系的研究报道很少，孙奕等对自然海区刺参消化管、体腔液和表皮的微生物区系进行了初步研究。王印庚等发现环境微生物种群及数量发生明显变化后与刺参疾病的发生具有显著的相关性。

唐黎等研究了刺参不同发育期和不同规格时消化道中蛋白酶、淀粉酶、褐藻酸酶、纤维素酶的活性，其中蛋白酶活力最高，纤维素酶最低。姚雪梅研究了不同条件下糙海参前肠、中肠及后肠的蛋白酶和淀粉酶比活力的变化。

刺参存在夏、冬两个休眠期，在此期间刺参不摄食、体质差；越冬保苗期时幼参易受细菌感染；冬春季节易发病，且经常伴随“吐脏”现象，不能摄食；刺参属底栖生物，喜岩石或沙砾底质，投苗密度和底质环境对它影响很大。

2.2　微生态制剂在刺参养殖中的应用前景

刺参生理生化和养殖方面的深入研究为微生态制剂在刺参养殖中的应用提供了理论基础。刘朝阳等报道了益生菌在刺参各个养殖时期的应用。袁成玉等对用微生态制剂喂养刺参的生长及消化酶的活性进行了研究，发现益生菌可以提高幼刺参的消化酶活性和成活率，并有促生长作用，对刺参肠道中淀粉酶、蛋白酶活性影响较明显，对纤维素酶活性影响较小，但未报道对肠道菌群的影响。

尽管微生态制剂在刺参养殖中有着广泛的应用前景，但由于受刺参生活习性、目前养殖方式等的限制，还未得到广泛的应用。首先，围堰养殖、池塘养殖是目前海参的主要养殖方式，一方面这些养殖方式存在着海水循环慢、海水易局部富营养化的缺点，极易于细菌的传播，引发疾病，另一方面这些粗放式的养殖方式不易开展益生菌投喂工作，易造成益生菌的浪费；其次，由于刺参特殊的生活习性，春冬季是发病高峰期，因此一些耐低温菌的筛选更加大了土著益生菌筛选的难度；再次，刺参属于底栖生物，食底泥、有机碎屑等，且对食物选择性低，工厂化养殖中如何将菌和饵料粘合又要保持菌活性，投喂的益生菌如何到达池底被刺参摄食等问题还有待进一步研究；最后，刺参发病时经常伴随“吐脏”现象，不能进行摄食，目前益生菌在何时以何种方式作用于刺参还不能确定。可见微生态制剂真正用于刺参养殖仍有很长的一段距离，但相对于抗生素、疫苗，它还是具有广阔的应用前景。

3　结语

尽管微生态制剂在我国起步比较晚，且自身存在一些弊端，如菌体稳定性差、活性难维持、必须在消化道中达到一定数量、不能与抗生素同时使用、对突发病作用甚微、使用技术未掌握等，但是微生态制剂相对于其它抗病途径而言，因其绿色、环保、安全等特点，仍然是抗生素最有潜力的替代品。在大量使用微生态制剂的同时，我们还要考虑生态安全、生态平衡的问题。

益生菌的功效提高可以通过以下几种途径实现：筛选有效的菌株，对菌株进行基因改造，几株益生菌联合使用，与有协同作用的成分联合使用。采用基因工程技术解决微生态制剂活菌失活问题，明确微生态制剂的作用机理，在不断加强应用研究的同时也加强其机理方面的深入研究，将会更好地为微生态制剂的广泛应用奠定基础。