单诺沙星在鲫鱼体内的药物代谢动力学研究

摘　要：以15mg/kg的剂量肌肉注射单诺沙星，研究其在鲫鱼体内的药物动力学代谢规律。取给药后不同时间的鲫鱼血浆，采用反相高效液相色谱法测定血浆中单诺沙星的质量浓度，用MPTCP软件进行数据处理和分析。结果表明，健康鲫鱼肌注给药的药时数据符合二室开放模型，主要药物动力学参数为：表观分布容积(V)为5.0990 L±0.061 5 L，分布半衰期(t1/2α)为0.527 5 h±0.008 1 h，消除半衰期(t1/2β)为286.9440 h±18.595 0 h，药时曲线下面积(AUC)为387.767 7/(mg/L)·h±23.7793/(mg/L)·h。单诺沙星在鲫鱼体内的主要药物动力学特征为分布快且完全，消除缓慢，作用时间长。

关键词：单诺沙星；药物动力学；鲫鱼

氟喹诺酮类药物是近20年来逐步开发和使用的新型合成抗菌药物，国外氟喹诺酮类药物用于水生生物疾病治疗较早。1986年意大利已用第2代氟喹诺酮类药物氟甲喹治疗鱼类全身性细菌感染，如治疗弧菌、肠炎等。随后盐酸沙拉沙星广泛用于治疗斑点叉尾鮰的肠道性败血病、革兰氏阴性菌引起的爱德华病及其他鱼虾疾病的治疗。这类药物具有经济、高效、抗菌谱广、毒副作用小、不易残留，特别是与其他抗菌素无交叉耐药性等诸多优点，因此，氟喹诺酮类药物是目前许多国家重点研究的药物，在鱼类细菌性疾病的防治上已成为重点的研究开发药物。

单诺沙星(Danofloxacin，DAN)与恩诺沙星(Enrofloxacin)和沙拉沙星(Sarafloxacin)一样属第3代氟喹诺酮类(Fluoroquinolone)动物专用药物，其甲磺酸盐为白色至淡黄色结晶粉末。本品由美国辉瑞公司最先推出，于1990年在墨西哥、秘鲁、巴西等国家上市。目前，在亚洲、北美洲和拉丁美洲等很多国家已批准用于治疗牛、猪、鸡等动物细菌和支原体引起的疾病，而且欧洲也有一些国家批准使用此药。此药在体内分布广，穿透力强，吸收快且完全，MIC低，因此是值得推荐的优良抗菌药物。

试验以鲫鱼做为研究对象，采用反相高效液相色谱法测定血浆药物浓度，探讨其在鲫鱼体内的药物动力学变化规律，以便为该药在水产养殖业中的应用提供理论依据。

1　材料与方法

1.1　试验用鱼

试验用鲫鱼由湖南农业大学水产基地提供，平均体重250 g±30 g。试验前，在水族箱中暂养5d，每箱5尾，每天按鱼体重的2%投喂饲料。试验前24 h停止投喂饲料，试验间不投喂饲料。

1.2　试剂与药品

单诺沙星原料粉，浙江国邦兽药有限公司生产，含量98.5%；单诺沙星标准品，美国森吉尔大药厂生产，含量99.9%；乙腈、正己烷为色谱纯试剂。

1.3　仪器设备

LC-2010-AHT岛津高效液相色谱仪，日本岛津公司产品；LXJ-64-OH高速台式离心机，北京医疗仪器修理厂；WH-Z微型旋涡混合器，上海沪西分析仪器厂；UV-2100紫外/可见分光光度计，莱伯泰科有限公司。

1.4　色谱条件的选择

固定相为shim-pak·C18(4 μm,416 nm×25 nm)不锈钢色谱柱，流动相为0.2 mol/L磷酸氢二钠6.2mL，加入0.1 mol/L柠檬酸93.8 mL，乙腈100 mL，超纯水100 mL，庚烷磺酸钠0.254 5g；流动相流速为1.0 mL/min，紫外检测波长283 nm，柱温30 ℃，在该条件下保留5 min。

1.5　给药及样品采集

肌肉注射单诺沙星15 mg/kg，分别于注射后5、15、30、45 min,1、2、4、6、8、12、24、48、72、96h时自尾静脉采血样，置于含有肝素钠粉的离心管中混匀，8 000 r/min离心15 min，分离血浆，所有样品于－20 ℃保存，待测。

1.6　血浆样品处理

准确吸取0.5 mL血浆样品于1.7 mL的微量离心管中，再加入1 mL乙腈混匀，于旋涡混合器上混合2 min，高速离心10min(15 000 r/min)，取上清液经0.45 μm孔径滤膜过滤，吸滤液20 μL作HPLC分析。

1.7　标准曲线的绘制

1.7.1　对照品标准曲线制作　取经110 ℃干燥的单诺沙星标准品10 mg配制成100 μg/mL的原液，置于4℃冰箱中保存备用。再分别配制50.0、25.0、10.0、5.0、2.5、1.0、0.5、0.05μg/mL不同质量浓度的标准液，另取一支不加药，做空白管，经0.45 μm孔径滤膜过滤，20 μL进样，HPLC测定。

1.7.2　血浆标准曲线制作　在9支1.5 mL的具塞离心管中各加入0.45mL的空白血浆，除第1管外，其余8管依次加入不同浓度单诺沙星标准液，于旋涡混合器上混合2min，使各管分别为10.0、8.0、6.0、4.0、2.0、1.0、0.5、0.05μg/mL的质量浓度。按“1.6.1血浆样品处理”方法处理后，取上清液20μL上HPLC，以上各标准曲线每个浓度平行测5次，以平均峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标做标准曲线，求出各标准曲线的回归方程和相关系数。以引起3倍基线噪音(S/N≧3)的药量浓度为最低检测限。

1.8　精密度测定

取单诺沙星标准母液，加入空白血浆中，配制成0.5、2.5、5.0μg/mL的药物浓度，按“1.6.1血浆样品处理”方法处理，经0.45 μm孔径滤膜过滤，上机测定。日内差测定为各浓度于1d内不同时间进行5次重复进样测定；日间差测定为各浓度每天进行重复进样测定，每个浓度平行测5次，连续5d。测出各浓度响应值峰面积的变异系数及总变异系数，以此估计定量方法的日内与日间精密度。

1.9　血浆样品回收率测定

取空白血清，分别加入甲磺酸单诺沙星标准品液稀释成0.5、2.5、5.0μg/mL质量浓度，按照“1.6.1血浆样品处理程序”处理后，经0.45 μm孔径

滤膜过滤，上机测定。

以上每个药物浓度做5次重复，另用流动相配制相应浓度的单诺沙星标准品液，直接进相同的样，获得各样品和盐酸沙拉沙星溶液的峰面积，将两组进行比较，计算回收率。回收率(%)＝预处理后测得的药物的量/实际药物的加入量×100%。

1.10　数据处理

本试验药动学参数计算和模型拟合采用MCPKP药物动力学软件分析。

2　结果

2.1　线性关系和灵敏度

单诺沙星对照品标准曲线在0.05 μg/mL～50 μg/mL浓度范围内线性关系良好(图1)，回归方程为：Y＝103404.4X－51 182.99(r＝0.999 2)。对照品高效液相色谱图见图2。结果表明各标准曲线在0.05 μg/mL～10μg/mL浓度范围内线性关系良好。

表1　单诺沙星在血浆回收率测定结果

Table 1　Returns-ratio of danofloxacin in plasma

Table 2　The determination of danofloxacin in precision

鲫鱼单剂量肌注单诺沙星(15mg/kg)后，肌注给药的药物动力学最佳数学模型为二级开放模型，即血药浓度与时间的关系可用下列方程式表示为C＝2.008 7e－1.314 0 t＋0.993 0 e－0.002 4 t)。血浆高效液相色谱图见图3，血药浓度时间-曲线见图4。

图3　血浆中单诺沙星液相色谱图

Fig.3　HPLC with UV spectrophotometric detection in plasma ofdanofloxacin

图4　鲫鱼肌注单诺沙星(15 mg/kg)的血药浓度-时间曲线

Fig.4　The plasma concentration vs time of danofloxacin after i.m.administration in crucian

2.4　主要药物动力学参数

采用MCPKP药物动力学软件进行血浆药物浓度-时间数据处理，房室模型分析表明，肌注给药的药物动力学最佳数学模型为二室开放模型，即血药浓度与时间的关系可用下列方程式表示：

C＝2.008 7 e－1.314 0 t＋0.993 0 e－0.002 4 t。

主要药物动力学参数见表3。

表3　鲫鱼肌注单诺沙星(15 mg/kg)的主要药动学参数

Table 3　The pharmacokinetic parameters of danofloxacin after i.m.administration(15 mg/kg) in crucian carps

3.1　肌注给药的药物动力学特征

健康鲫鱼肌注单诺沙星(15 mg/kg)后，分布半衰期(t1/2α)为0.527 5 h±0.008 1h，表明该药肌注吸收迅速，肌注后0.25 h，血药浓度达(0.793 μg/mL)超过该药对临床上常见细菌的最小抑菌浓度(0.5μg/mL)。消除半衰期为(t1/2β)286.944 h±18.595 0 h，表明消除缓慢，在体内滞留时间长。在给药12h后，血药浓度(1.566μg/mL)仍远远大于该药临床上常见细菌的最小抑菌浓度。因此，能够长时间维持有效血药浓度，达到治疗疾病的目的。总的说来，该药物在鲫鱼体内吸收非常迅速、分布快，但消除缓慢。

3.2　药物动力学参数比较研究

据报道，健康猪以5 mg/kg剂量静注、肌注及

口服沙拉沙星后，生物利用度为76%及89%，消除半衰期分别为8.0、6.8、9.8h，药时曲线下面积为2.9、6.0、7.0(mg/L)·h，肌注和口服给药的Tmax为0.8 h和3.3h，Cmax为0.80、0.42 μg/mL，表明该药肌注在猪体内较鲫鱼体内吸收慢。消除半衰期为3.53h，表明肌注在猪体内较鲫鱼体内消除快。健康鸡静注、肌注单诺沙星(10 mg/kg)后，吸收半衰期为0.22 h，达峰时间为0.67h，表明肌注该药在鸡体内较鲫鱼体内吸收更为迅速；消除半衰期为5.19 h，表明该药消除比鲫鱼快得多。

房文红等在24 ℃时对斑节对虾单次肌注诺氟沙星的研究表明，血淋巴中药物时间数据符合二室开放模型，分布和消除半衰期分别为0.0635和0.612h。与本试验结果比较，可见单诺沙星在水生生物体内比环丙沙星、诺氟沙星消除更缓慢，这些药物动力学上的差异，可能与这类药物之间的化学特性有关，同时与动物种属、性别及水温、水质等多种环境因素有很大的关系，因此动力学上的差异要比恒温动物复杂的多，开展药物在水生动物中动力学研究就显得尤为突出和重要。

总的说来，单诺沙星的药动学特征与其他氟喹诺酮类药物相似，吸收迅速，达峰时间短，消除缓慢，说明这类药维持有效血药浓度时间较持久，给药间隔时间长。该类药在水产养殖方面推广应用，必须制定严格的休药期，以避免药物的残留。