牛病毒性腹泻病毒基因组结构与蛋白功能研究进展

摘　要：牛病毒性腹泻病毒为黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)的代表种，这个属的成员中还包括羊边界病毒(BDV)和猪瘟病毒(CSFV)。病毒基因组为单股正链RNA。论文就牛病毒性腹泻病毒已定位的4种结构蛋白、8种非结构蛋白以及3′和5′非翻译区的基因结构特征及其编码蛋白的合成与功能研究进行了综述，为牛病毒性腹泻的防控和疫苗研制提供参考。

关键词：牛病毒性腹泻病毒；基因组结构；蛋白功能

牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)可引起许多临床症状和一些疾病，包括繁殖障碍、呼吸综合征、先天性缺陷、肠炎、持续感染(PI)和黏膜病(MD)等，易感动物除牛以外，还包括骆驼、绵羊、山羊、猪、鹿及多种野生反刍动物。该病毒呈世界性分布，广泛分布于美国、澳大利亚、新西兰、匈牙利、加拿大、阿根廷、日本、印度以及非洲和欧洲许多养牛发达国家，是危害养牛业的重要病原之一。研究发现，其感染宿主涉及到了大部分偶蹄家畜和部分野生偶蹄动物。每年死于BVDV感染的牛不少于500万头，占饲养牛总数的0.5%～1%。BVDV感染怀孕母畜，造成胎儿产生免疫耐受，进而发展为持续性感染病畜，多数持续性感染动物外观健康，但生产性能下降，且成为重要的传染源。BVDV还是牛源生物制品(血清、冻精、胚胎、疫苗等)的污染源，给畜牧业生产和相关商业领域造成巨大的经济损失。

1　BVDV基因组结构

BVDV基因组为单股正链RNA，长度为12.3 kb～12.5 kb，包括一个5′非翻译区 (untranslatedregion,5′UTR)，一个编码4种结构蛋白的(p14、gp48、gp25和gp53)和8种非结构蛋白(p20(Npro)、p7、p125(NS2-3/NS3)、p10(NS4A)、p30(NS4B)、p58(NS5A)和p75(NS5B))的开放阅读框(openreadingframe，ORF)以及一个3′非翻译区(3′UTR)。其5′UTR含有复制所需要的顺势作用元件和一个非帽依赖的翻译起始所需的内部核糖体进入位点(internalribosom entry site，IRES或ribosomol landingpads，RPL)；3′UTR含有参与RNA复制的信号；开放阅读框，可被靶细胞核糖体转录翻译成一个大约4000个氨基酸残基的前体蛋白。

2　BVDV的5′-UTR和3′-UTR

BVDV的5′-UTR约由380～385个核苷酸组成，5′末端无甲基化的“帽子”结构，5′-UTR序列在各BVDV毒株间有较高的保守性，因此常根据5′-UTR的序列合成引物来检测BVDV或用于对BVDV的分型。BVDV的5′-UTR中有6个AUG，但这些AUG均不能启动蛋白翻译，也没有相应的表达产物，BVDV的5′-UTR具有相当保守且稳定的二级结构。Deng建立了瘟病毒属5′-UTR的二级结构模型，以BVDV-1NADL株较为典型，分为A、B、C、D 4个功能区，其中C区是一个保守的不完全茎-环结构，D区占5′-UTR的2/3，其二级结构较为保守。5′-UTR内部有核糖体结合位点，核糖体中的18 SrRNA 3′保守序列GUCGAAACAAGG与瘟病毒5′-UTRIRES结合，在空间上有利于从ORF的AUG处启动翻译，这种结合不依赖于5′端的结构，在BVDV-2IRES决定病毒的毒力。瘟病毒属5′-UTR序列高度同源性和相似的二级结构说明，这一结构在病毒转录、翻译过程中起重要作用，瘟病毒属病毒可能以相似的机制进行转录和翻译。

BVDV 3′-UTR由223个～230个核苷酸组成，始于ORF的终止密码子TGA,3′末端缺乏Poly(A)“尾”结构，3′-UTR内有60bp富含AT的序列，有1个8核苷酸重复序列(TATATATA)，另外，3′-UTR中还存在两段50bp的相似序列(序列中有30个核苷酸是相同的)。已证实，黄病毒科3′-UTR及5′-UTR参与病毒的复制和调控，与病毒复制酶(p75)对RNA模板链的识别有关。

3　BVDV的大开放阅读框架

BVDV的ORF编码一个近4000个氨基酸的多聚蛋白。多聚蛋白由细胞和病毒基因编码的蛋白酶在翻译的同时或翻译后加工至少1种成熟的蛋白质，编码蛋白质的基因在基因组对应的位置为5′-p20(Npro)–p14(C)-gp48(E0)-gp25(E1)-gp53(E2)-p7-p125(NS2-3)-p10(NS4A)-p30(NS4B)-p58(NS5A)-p75(NS5B)-3′，其中p14、gp48、gp25、gp53是病毒的结构蛋白，其余为非结构蛋白。

多聚蛋白经加工后，最先形成的是p20蛋白和前体蛋白Prgp140、p125和PrP175。p20蛋白是BVDVN端的第1个产物，Prgp140是病毒结构蛋白的前体分子，分子质量为140ku的糖蛋白，对Prgp140的加工主要是在内质网上由宿主细胞的信号肽酶裂解，Prgp140首先裂解为Prgp116，最后加工成gp53、gp48和gp25，无论是在感染的宿主细胞中还是病毒粒子上，这三种糖蛋白分子间均通过二硫键连接，形成二聚体。糖蛋白的这种二聚体对病毒粒子的装配十分重要，正是这些二聚体共同构成病毒的囊膜结构，这种结构在其他病毒中尚未发现。PrP175是病毒非结构蛋白前体分子，首先裂解为PrP165，再依次裂解为p10、p30、p58和p75。

BVDV不同毒株间ORF内部结构蛋白及非结构蛋白p54、p58区在核苷酸序列及氨基酸序列上较其他区域变异大，对结构蛋白和非结构蛋白p54氨基酸的序列进一步分析，得到4个保守区C1、C2、C3、C4和3个高变区V1、V2、V3。平均氨基酸的同源性达到90%以上的为保守区，平均氨基酸同源性低于70%的为高变区。C1、C2和C3区分别位于病毒核蛋白p14和糖蛋白gp48和gp25，C4区域位于gp53和p53的连接处。三个高变区中，V1、V2位于病毒糖蛋白gp53上，疏水性分析表明，V1、V2区是亲水的，说明V1和V2存在于病毒粒子的外表面，因此推测V1和V2的结构域可能是糖蛋白gp53的保护性抗原表位。第3个可变区V3是最大的一个，位于非结构蛋白p54的N末端，尽管这一区域的主要氨基酸序列是高度可变的，但其疏水性在瘟病毒属中是恒定的，表明其功能性选择是由其疏水性，而不是由其氨基酸的序列决定的。

4　BVDV的结构蛋白

BVDV编码的结构蛋白主要位于BVDV基因组的5′-N端部分。前体蛋白Prgp140经蛋白水解酶的切割和糖基化酶的修饰，被加工成为成熟的病毒结构蛋白p14、gp48、gp25和gp53，其中gp48、gp25和gp53是糖基化蛋白。

4.1　核心蛋白p14

核心蛋白p14又称C，是非糖基化蛋白，位于ORF的505位～810位核苷酸，由102个氨基酸残基组成，分子质量约14ku。p14蛋白疏水性很强，N端由p20水解产生，C端由宿主细胞的信号肽切割产生，是BVDV的核衣壳组成成分，与病毒基因组RNA构成病毒核心。Elahi等构建了表达p14基因的重组腺病毒，将其免疫小鼠后，免疫小鼠脾细胞与BVDV-1和BVDV-2均能产生特异性免疫反应，表明p14蛋白具有免疫原性。

4.2　病毒囊膜结构蛋白

组成病毒囊膜结构的3种糖蛋白，依次为gp48、gp25和gp53，序列分析结果表明，病毒结构蛋白的这几个区域高度不均一，尤其是gp53糖蛋白的变异较大，推测糖蛋白区内的保护区域是由于功能选择的结果，它对病毒RNA的装配或病毒粒子的组装、病毒与受体或感染宿主之间的相互作用非常重要。3种糖蛋白N末端加工位点附近序列在不同瘟病毒之间具有较高的保守性，说明所有瘟病毒糖蛋白成熟方式可能一致。

4.2.1　囊膜蛋白gp48　囊膜蛋白gp48又称E0或Erns，位于ORF的811位～1491位核苷酸，由227个氨基酸残基组成，有8个可糖基化位点，去糖基化分子质量约为27ku。该蛋白缺乏膜锚定位点，而以一种至今未知的机制与细胞相连。在病毒粒子中，gp48以100ku大小的同聚体存在，在细胞信号肽酶的作用下，其N末端从多聚蛋白上裂解下来，可被分泌到宿主细胞外。gp48有其特有的RNase活性，但该活性在瘟病毒增殖及使机体致病过程中所起的作用尚不清楚，对gp48RNase活性的研究有可能为BVDV防治找到新的途径。gp48是BVDV编码蛋白中保守性很高的蛋白，其上有中和表位，产生的中和抗体具有中和BVDV和CSFV的能力。氨基酸序列分析结果表明，在这一蛋白内有一高度保守结构域，因此它可用于研究基因工程亚单位疫苗，也可作为基因工程诊断抗原。

4.2.2　囊膜蛋白gp25　囊膜蛋白gp25又称E1，位于ORF的1 492位～2076位核苷酸，由195个氨基酸残基组成，非糖基化蛋白分子质量约为20ku，含有2个糖基化位点。C末端在细胞信号肽酶的作用下从多聚蛋白上裂解下来。gp25蛋白氨基酸序列中有2段高度疏水区，以C端的疏水区锚定在BVDV囊膜上，gp25可能在病毒包装、成熟过程中协助E0的定位，推测gp25埋在病毒囊膜内，是一种膜锚定肽，不能诱导免疫反应。

4.2.3　囊膜蛋白gp53　囊膜蛋白gp53又称E2，位于ORF的20 077～3198位核苷酸，由374个氨基酸残基组成，非糖基化蛋白分子质量约为42ku。含有19个Cys残基和5个可能的N-连接的糖基化位点，这些位点在BVDV不同毒株中非常保守。gp53多以同源二聚体形式存在，或以异源二聚体gp53-P7形式存在，在细胞信号肽酶的作用下从多聚蛋白上裂解下来。gp53C端含有一个疏水的膜锚定区，通过这一疏水区锚定在囊膜上。gp53靠近N末端的一半含有多种依赖于构象的抗原结构域，其N端伸出BVDV囊膜表面，是决定BVDV抗原性的主要部位，也是与抗BVDV抗体结合、介导免疫中和反应与宿主细胞识别、吸附的主要部位。gp53具有中和活性，其N端有两个抗原决定区，一个是在种内保守的主要抗原区，另一个是决定不同毒株的抗原特异性区域。gp53是BVDV结构蛋白中变异率较高的一种蛋白，中和逃逸频率为10-2.47，已证实，NADL株838位氨基酸残基D-N(Asp天冬氨酸-Asn天冬酰胺)突变可引起对抗体的中和逃逸。gp53的变异使BVDV对环境有较好的适应性，是导致疫苗保护失效和牛持续感染的主要原因之一。

5　BVDV非结构蛋白

p20(Npro)、p7、p125(NS2-3)、p10(NS4A)、p30(NS4B)、p58(NS5A)和p75(NS5B)为BVDV的非结构蛋白，在这8种非结构蛋白中，NS3、p10(NS4A)、p30(NS4B)和p58(NS5A)共同形成复制复合体，p75(NS5B)具有依赖RNA的RNA聚合酶活性，是BVDV的复制酶，在病毒复制过程中，以上5种非结构蛋白必须参与，而其余3种即p20(Npro)、p7和NS2是非必须的。

5.1　p20(Npro)

p20(Npro)是瘟病毒属所有成员基因组单一ORF编码的第一个蛋白。p20(Npro)是一种自我裂解的蛋白酶，产生自身的C末端，由于其位于病毒多聚蛋白序列的N端，故得此名。比较BVDV、CSFV和BDV的氨基酸组成，发现它们p20(Npro)的同源性大于70%，而且对保持p20(Npro)蛋白裂解活性所必须的Glu22、His49和Cys69残基高度保守，位于裂解点附近的Cys168和Ser169也很保守。单核细胞和巨噬细胞是BVDV感染的主要靶细胞，它们也是感染性病毒的贮存库，可将BVDV传播到不同组织中，并参与诱导免疫调节。研究发现，nCP型BVDV干扰双肌胞苷酸Poly(IC)诱导的牛陀螺状细胞的凋亡以及牛巨噬细胞产生IGF，可能也是p20(Npro)作用的结果。

5.2　p7

编码瘟病毒E2和NS2的基因被一个编码p7小肽的序列分开。p7的分子质量大约为6 ku～7ku，主要由疏水氨基酸组成，E2和p7之间的裂解由宿主信号肽介导，在瘟病毒感染的细胞中，E2-p7的裂解效率不高，结果得到2种类型的E2，即E2和E2-p7。用双顺反子全长BVDVRNA转染试验和反式互补试验研究表明，在RNA复制和感染性病毒粒子形成时，E2-p7均是非必须的，但还需确定它是否在自然宿主适应性方面有作用。将突变引入BVDV的感染cDNA，框内缺失全部的p7不影响RNA复制，但产生的病毒粒子无感染，用辅助病毒对p7进行反式互补后，又可获得感染性病毒，这一结果提示，瘟病毒p7对产生感染性子代病毒是必需的。在其他病毒中，已报道了一些与p7有相似特性的蛋白。甲病毒疏水的6K多肽具有与丙型肝炎病毒(CSFV)p7相应的拓扑学。用反向遗传学研究了6K的生物学作用，表明该分子在病毒粒子的装配及随后的病毒从哺乳动物细胞质膜中释放具有重要作用。报道CSFVp7蛋白形成的粒子通道可被长链烷基亚氨糖衍生物所抑制，而该药物对代替CSFV的BVDV有抗病毒活性，即用它治疗后，产生的BVDV没有感染性，所以p7可作为抗病毒治疗时的一个目标。

5.3　p125(NS2-3)、NS2和NS3

不同瘟病毒之间以及统一瘟病毒的不同毒株之间，NS2-3的裂解位点的裂解程度变化很大。就CSFV而言，对NS2-3位点的不完全裂解，导致产生了NS2-3、NS2和NS3。根据各毒株在组织培养时有无细胞病变，BVDV被分为两种生物型，即细胞病变型(CP型)和非致细胞病变型(nCP型)。通常NS2-3裂解产生的NS3是CP型BVDV的一个标志。故在CP型BVDV感染的细胞中既有NS3，又有NS2-3。但nCP型BVDV中，NS2-3位点的裂解未发生，所以只能观察到NS2-3。通常以下情况可导致NS3的产生，BVDV序列的重排与复制，宿主细胞序列的插入以及框内缺失产生亚基因组缺损干扰RNAs。

研究表明，NS2基因对CSFV的复制是非必需的。基因组中缺少了NS2基因时复制更为有效，并引起细胞病变，表明它具有调节功能，对于NS2蛋白的生物学功能尚未见报道。

NS2-3和NS3为多功能蛋白，能与RNA结合，具有NTP酶、解旋酶和蛋白酶活性，其丝氨酸蛋白酶活性位于NS3的N末端，由1658位组氨酸(H1658)、1 686位天冬氨酸(D1686)和1752位的丝氨酸(S1752)共同组成催化三联体(12＋9)，催化下游NS3-4A、NS4A-4B、NS4B-5A和NS5A-5B位点裂解。NS3最小的蛋白酶结构域大约含209个氨基酸，NS3蛋白酶对N末端截短很敏感，缺少6个氨基酸，NS4A-4B位点的裂解效率就明显降低，CP型BVDV各毒株间的NS3的N末端高度保守，NS3N端延长或缩短均会严重干扰病毒RNA的复制。Tautz等认为，CP型BVDV各毒株间NS3保守的N端是功能选择的结果，而不是重组中存在的热点。

5.4　p10(NS4A)和p30(NS4B)

NS4A由64个氨基酸组成，在瘟病毒中高度保守，与CSFV54个残基的NS4A相似。瘟病毒的NS4A蛋白N末端是疏水的，其C末端带电荷的程度高。NS4A位NS3蛋白酶的辅助因子。NS3严格依赖于NS4A完成对NS4A和NS4B、NS5A和NS5B间位点的裂解。CSFVNS4AN末端疏水区负责与膜相连，并稳定NS3-4A蛋白酶复合体，中央有一个多肽具辅助因子活性。而瘟病毒NS4A中央区含有保守的带电残基，形成了其辅助因子的结构域。NS4A与NS3的N端结合，对NS3的N末端的缺失很敏感。

NS4B有347个氨基酸组成，分子质量为38 ku～39ku。瘟病毒的NS4B呈碱性，含几个疏水区，可能与膜相连，有报道NS4B在病毒致细胞病变中有一定作用，突变可以减弱BVDV致细胞病变性。在NADL感染的细胞中，NS3、NS4B和NS5A有化学交联，表明这3种非结构蛋白组成了一个多蛋白复合体，并且在病毒复制过程中，NS4B必需参与，是顺式作用因子。

5.5　p58(NS5A)

NS5A由496个～497个氨基酸组成，分子质量55 ku～56ku。NS5A为亲水性的，在细胞感染中相当稳定，其丝氨酸和苏氨酸残基有磷酸化现象。黄病毒科各成员中的NS5A均有磷酸化现象，它们在病毒生命周期中具有重要作用。在病毒复制过程中，NS5A必不可少。有报道表明BVDVNS5A蛋白可与翻译延伸因子1的a亚基(eEf1A)相互作用，这种作用很保守，无论是CP型或nCP型毒株，还是Ⅰ型或Ⅱ型基因型，尽管它们的NS5A蛋白仅有77%的同源性，但它与eEf1A的结合能力却十分保守。这种NS5A与eEf1A的相互作用可能对BVDV的复制有一定作用。

5.6　p75(NS5B)

BVDV编码基因位于基因的3′末端，与3′NCR相邻，这与CSFV中NS5B的基因定位相同。CSFV、BVDV的NS5B异源表达表明它们均具有依赖RNA的RNA聚合酶(RdRp)活性。RNA病毒主要通过两种机制起始RNA合成，即从头起始机制和引物依赖合成机制。一种病毒可采用一种或多种起始机制。Ranjith-Kumar等应用一个既能从头起始又能引物延伸的模板，发现BVDVRdRp和CSFV RdRp在Mn2＋存在的条件下明显偏爱从头起始机制；相反在Mg2＋不存在的条件下，CSFVRdRp偏爱进行引物延伸。并且他们还发现尽管黄病毒科的RdRp具有从头起始机制，但每种RdRp具有不同的喜好。BVDVRdRp只有在在Mn2＋存在的条件下，才可使用GDP和GMP有效起始RNA合成。在RNA合成起始时所需的GTP浓度比延伸时高。

瘟病毒属的NS5B蛋白除了有RdRp活性外，还具有末端核苷酸转移酶(TNTase)活性。

6　展望

在过去的十多年中，对瘟病毒结构基因的定位均已完成，对主要结构蛋白的结构和功能进行了比较系统的研究，而对非结构蛋白结构和功能也进行了较为深入的研究，取得了一定的进展。但相对CSFV的研究，BVDV依然有很大未经涉足的研究空间。如病毒转录时需要启动哪些宿主细胞的基因参与，病毒翻译时需求哪些宿主细胞成分，一些非结构蛋白基因对病毒自身转录翻译及调控的功能，以及非结构蛋白在对抗宿主细胞中的作用和机理等。