犬细小病毒病研究进展

摘　要：犬细小病毒病是由犬细小病毒感染幼犬所引起的一种急性传染病。临床上有两种表现型，出血性肠炎型以剧烈的呕吐、出血性肠炎和白细胞显著减少为主要特征；心肌炎型则以突然死亡为特征。无论那种类型的临床表现，均以发病率高、死亡率高和传染性强为特点，是危害养犬业最为严重的传染病之一，可造成严重的经济损失。论文从病毒生物学特性、基因组结构、病原的检测方法，流行病学、发病机理及病理变化、临床症状以及疫苗研制等角度对犬细小病毒病近年来的研究进展做以概述。

关键词：犬细小病毒；生物学特性；基因组结构；疫苗

犬细小病毒病是由犬细小病毒(Canine parvovirus，CPV)感染幼犬引起的一种急性传染病，以剧烈的呕吐、出血性肠炎和白细胞显著减少以及心肌炎为主要特征，发病率高，传染性强，死亡率高，是危害我国养犬业最为严重的传染病之一，可造成严重的经济损失。1977年，美国学者Eugster和Nairn最先从患出血性肠炎的犬粪便中分离得到该病毒，其后，加拿大、澳大利亚、法国、日本等国均有此病发生的报道。1982年，我国梁士哲等最早报道了类似CPV所致的犬出血性肠炎；1983年，徐汉坤等正式确认本病的流行。犬细小病毒的发现只有30年的时间，但该病毒对犬的感染危害严重，世界各国对该病毒生物学特性及其疫病的防制进行了大量的研究工作。本文就病毒生物学特性及其基因组结构、流行病学、发病机理及病理变化、临床症状、疫苗研发以及病原的检测方法等方面的研究进展进行概述。

1　CPV的生物学特性

1.1　一般特性

CPV属于细小病毒科(Parvoviridae)细小病毒属(Parvovirus)，病毒粒子无囊膜，核衣壳为等轴对称的20面体，电镜下呈圆形或六边形，直径为21nm～24 nm。单股DNA，DNA量约占整个病毒粒子重量的25%～34%，分子质量1.4×106～1.7×106，沉淀系数为23S～27 S。CPV对外界的抵抗力较强，对酒精、***、氯仿有抵抗性，对温度也有一定耐受性。65 ℃、30min而不失其感染性，低温长期存放对其感染性并无明显影响。在4 ℃～10 ℃存活6个月，37 ℃存活2周，56 ℃存活24 h,80℃存活15 min，在室温下保存3个月感染性仅轻度下降，在粪便中可存活数月至数年。对CPV最有效的消毒剂有福尔马林、β-丙内酯、次氯酸钠、氧化剂等。此外，紫外线也能使其失活。CPV具有较强的血凝活性。能凝集恒河猴、猪、仓鼠、猫和马的红细胞，而不能凝集其他动物的红细胞，这一特性可作为病毒鉴定的参考指标。经福尔马林灭活后，其血凝性几乎不变。

1.2　抗原性

CPV-2是继Binn等1967年从犬中分离到的第二种细小病毒，它与Binn早期从健康犬分离的犬极小病毒(Minute virusofcanine，MVC)在致病性上显著不同，抗原性上也有明显差异。迄今为止，CPV只有一个抗原型，即CPV-2，但不同毒株间抗原性有所差异，已出现了多个亚型，即CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c(a)和CPV-2c(b)。CPV-2型出现后很快世界广泛传播，该病毒可能由猫的FLV变异而来，通过野生的犬科动物如貂和狐狸，适应了新的宿主犬，连续传播几年后，CPV已经发生抗原漂移，在抗原性、宿主范围和血凝性上都发生了变化，MaraB等研究证实CPV-2与RNA病毒相似，表现有高的遗传异质性。Parrish等报道，1978年－1980年分离的毒株是CPV-2型，1980年后分离的毒株又是另一个型，Parrish等提出将新的毒株命名为CPV-2a，以表明是CPV-2的亚型，能感染犬和猫。很快，最初的CPV-2被CPV-2a完全替代。较CPV-2而言，CPV-2a在VP2外膜蛋白上有5个氨基酸的改变，已证明这些氨基酸代表了抗原和宿主范围的病毒特性。1984年，出现了另一种新的抗原变异株，命名为CPV-2b，一般和CPV-2a混合感染，两者不同之处在CPV-2b衣壳的主要抗原位点有1个氨基酸(Asn426Asp)替换。随后应用单克隆抗体发现，Asn/Asp426Glu替代引起抗原的改变。因此，有的研究者将Glu-426变异株作为一个新的型，命名为CPV-2c，目前已普遍采用这个名称。在越南、西班牙、意大利、德国、英国、乌拉圭已经发现CPV-2c，说明CPV-2c和CPV-2a/2b一样，也形成世界范围的广泛分布，且有逐步取代其他型的趋势。

我国的CPV分离株也存在基因变异现象，CPV-2曾在20世纪80年代早期流行，但1986年后分离到的CPV以CPV-2a为主，CPV-2a和CPV-2b广泛并存。除发现CPV-2、CPV-2a、CPV-2b突变株外，还发现在CPV-2a基础上进一步进化产生的2个新的变异株，其确切的生物学意义尚不清楚。我国的CPV分离株与参考毒株的核酸同源性超过98%，没有形成明显的中国CPV分支，进化方式与文献报道的进化方式一致，这与CPV在意大利、澳大利亚、英国和印度的流行情况相似，巴西等国以CPV-2b为主。而在中国台湾，先前的报道CPV-2a占优势地位，WANG Hsien-chi等研究发现在台湾中部却以CPV-2b为主，这说明优势是相对的，而不断进化是绝对的。

很多研究证实，CPV与FPLV (猫泛白细胞减少症病毒)、MEV(水貂肠炎病毒)之间有共同的抗原组成，能发生交叉血清学发应，但又有各自的抗原成分。CPV与PPV(猪细小病毒)之间也有某些共同的抗原组成，两者之间能出现免疫荧光和血凝抑制交叉现象。

2　CPV基因组结构及其编码的蛋白质

2.1　CPV基因组结构

CPV基因组为单股负链DNA，全长5 323nt。CPV基因组包括2个开放阅读框(ORF),5′端ORF编码非结构蛋白(668个氨基酸)，即早期转录的调节蛋白(NS1和NS2)；3′端ORF编码结构蛋白(722个氨基酸)，即晚期转录的病毒衣壳蛋白(VP1和VP2)。整个编码区基因是相互重叠的，结构基因和非结构基因有各自独立的启动子区域，即晚期启动子和早期启动子。CPV结构含有TATA序列转录起始区和刺激蛋白SP1的结合位点，这些序列的转录激活对于启动子的活性具有重要的作用。编码结构蛋白和非结构蛋白的mRNAs共同终止于Poly(A)处，Poly (A)序列下游(40nt)有TATA序列。CPV基因组另一显著特点是3′端和5′端各有一个发夹样的回纹结构，一般由120 bp～160bp碱基组成，但整个发夹结构又被两个短的回纹序列中断，因而末端序列可折成T形或Y形结构，这一结构对病毒的复制是十分重要的。

2.2　编码的蛋白质

CPV基因主要编码4种蛋白(VP1，VP2，NS1，NS2)，其中VP1和VP2为结构蛋白，NS1和NS2为非结构蛋白。病毒空衣壳中只含有VP1和VP2两种蛋白，VP2是构成衣壳蛋白的主要成分，VP2位于VP1的C端，VP1蛋白的C端氨基酸和VP2蛋白的N端氨基酸序列相互重叠，且二者终止于同一密码子。VP1和VP2蛋白在病毒感染过程中起着极为重要的作用，缺失VP1或VP2蛋白的突变体均丧失了对宿主细胞的再感染性。此外，成熟的病毒粒子还含有VP3蛋白，VP3是VP2的裂解物，它只在衣壳装配和病毒基因组包装后才出现，研究较多的主要是VP2结构蛋白，CPV的中和抗原位点位于VP2上，VP2蛋白是CPV的免疫原性蛋白，编码CPV的主要抗原决定簇，可诱导机体产生中和抗体。VP2基因的N端以及该基因上的蛋白转角结构区loop1和loop3是重要的B细胞抗原表位区，可诱导机体产生中和抗体。VP2基因全长1755nt，编码584个氨基酸，VP2上的几个关键碱基和氨基酸的变化就会改变抗原特性和宿主范围。结构和功能研究表明，衣壳上的纤突决定着细胞向性、宿主范围和进化。这些区域氨基酸残基的变化是导致CPV毒株抗原漂移的主要原因。VitoM等研究证实，CPV衣壳主要抗原区氨基酸的改变不仅导致了病毒进化，也改变了抗原构象。

3　流行病学

犬是本病的主要自然宿主，各年龄和不同性别的犬都易感，但幼犬的易感性最高。一年四季均可发病。饲养管理条件骤变、长途运输、寒冷、拥挤均可促使本病发生。病犬是主要的传染源，呕吐物、唾液、粪便中均含有大量病毒。康复犬仍可长期通过粪便向外排毒，健康犬与病犬或带毒犬直接接触，或经污染的饲料和饮水通过消化道感染。研究表明，人、虱、苍蝇和蟑螂可成为CPV的机械携带者。

4　发病机理及病理变化

感染是由病毒侵入所致，最小感染剂量可能小至100 个TCID50。病毒侵入后在感染的头两天，在口咽部复制，通过血流传播到其他器官，3d～5 d 后出现病毒血症。虽然通常肠炎病症明显， 但细小病毒感染是全身性的。病毒通过血流而不是肠腔到达肠黏膜。病毒主要攻击2种细胞：肠上皮细胞和心肌细胞。已证实转铁蛋白受体(TfR)是CPV病毒的细胞表面受体。在犬间，CPV-2经口鼻迅速传播，病毒开始在咽喉部淋巴组织、肠系膜淋巴结和胸腺内复制，而后传播到小肠的肠隐窝。CPV感染肠隐窝胚上皮组织，引起上皮组织破坏和萎陷，导致正常的细胞更新被损害，肠绒毛变短。主要发病部位在肠道和心脏，病犬肠道各段黏膜上皮细胞均坏死、脱落，固有膜暴露。肠腺上皮细胞也有程度不同的坏死、脱落。心肌细胞变细、变长，局部断裂、崩解，间质水肿，心肌毛细血管扩张、充血。脾脏和淋巴结中淋巴细胞数量减少。其他各器官都有不同程度的充血、出血以及炎性细胞侵润。CPV-2主要分布在胃肠道上皮、舌、口腔和咽喉部黏膜、小肠和淋巴组织(如胸腺、淋巴结和骨髓)。另外，可以从肺、脾、肝、肾和心肌中分离到病毒。CPV-2还破坏循环中淋巴细胞和淋巴样细胞的活性。在严重感染的情况下，常常出现中性粒细胞减少症和淋巴细胞减少症。通常在感染后的3 d～4d即可通过粪便向外界排毒，此时病毒呈单个散在，传染性也最强。7 d～10 d 后随着肠黏膜IgA的产生和随出血进入肠道的IgM等CPV特异抗体的增多，散在的病毒被凝集在一起，感染性降低，血凝性也大大降低甚至丧失。同时可以检测到血清抗体，血清抗体可以在体内保持至少1年。

5　临床症状

5.1　肠炎型

常见于6月～12月龄幼犬和成年犬，潜伏期7 d～14d，病犬初期精神沉郁，厌食，突然呕吐，偶见发热，软便。病初粪便呈灰色，黄色或乳白色，带果冻状黏液，后排出恶臭的酱油样或番茄汁样血便，具有难闻的恶臭味。病犬迅速脱水，消瘦，毛乱，皮肤无弹性，精神高度沉郁，直至衰竭而死亡。病程一般为1周左右。剖检可见病死犬脱水，腹腔积液。主要是小肠中后段浆膜下充血，肠内容物水样，并混有血液和黏液。

5.2　心肌炎型

多见于4周龄～6周龄幼犬，突然发病，病初轻度腹泻或呕吐，尔后很快死亡，死亡率高。心肌炎临床症状表现各不相同，有的呈急性腹泻且没有心脏病症状而死亡；有的呈腹泻症状，康复后数周或数月因充血性心衰竭而死亡；有的是6周龄至6月龄的正常犬突发充血性心衰竭而死亡。剖检病死犬可见肺表水肿、出血，心脏扩张，肌纤维变性、坏死。心肌炎型可能与犬自然感染CPV-2a和CPV-2b 有关。

6　犬细小病毒病疫苗

预防犬细小病毒病的疫苗最早是使用经福尔马林灭活的FPLV疫苗，也有弱毒疫苗，但免疫效果远不如同源疫苗，目前基本上是用同源疫苗，已有部分活疫苗、灭活疫苗商品化，尚有大量的处在研究阶段，其中多数是建立在分子生物学基础上的基因工程疫苗。国内主要采用国产或进口的CPV弱毒疫苗进行免疫。

6.1　弱毒苗

近年来使用的疫苗大多数是在CPV-2基础上改进的活疫苗，可有效防控犬细小病毒病，也能抵抗变异株如CPV-2b的攻击。当母源抗体不能提供足够的保护(NicolaDecaro等研究认为，母源抗体HI≥80可以提供全面保护)，就会有许多犬在出生后1周内发生感染。中和试验已证明抗原型不同，抗体水平不同，当母源抗体处于最小保护滴度时，这种不同在临床上有可能很重要。同时母源抗体亦干扰免疫接种，从而造成免疫接种失败。从貂体中分离得到一株细小病毒CR86106，能克服母源抗体的干扰，遗传稳定，免疫效果好，已成为我国预防CPV的弱毒疫苗株。一般而言，疫苗应包含最新的抗原型，能够提供最完整的保护。对于细小病毒，在过去30年，衣壳蛋白改变很小，理论上讲，不论哪种新毒株，CPV-2疫苗都能够提供足够的保护。RonaldD S对美国市场上的犬苗试验发现，CPV-2最小免疫持续期在3年以上，说明现有的疫苗均可提供良好的保护力，而且不需要每年重复接种，是否需要重复接种，则依赖于血清学检测结果。但欧洲已有以新型病毒株制造的疫苗获得许可。

由于CPV弱毒苗与犬瘟热、犬副流感病毒、狂犬病、犬传染性肝炎等弱毒苗联合使用时，相互间无干扰现象，使得联苗成为犬病防控的主体。商品化的有：犬瘟热、细小病毒病二联活疫苗，犬瘟热、细小病毒病、犬腺病毒、副流感四联活疫苗，犬瘟热、细小病毒病、犬腺病毒三联活疫苗，狂犬病、犬瘟热、细小病毒病、犬腺病毒、副流感五联活疫苗等，临床应用效果均不错。弱毒疫苗存在毒力返强的危险，使其应用受到了一定的限制。

6.2　灭活苗

相对于弱毒疫苗，灭活疫苗种类比较少。Eugster等报道用犬源灭活苗预防CPV感染，取得了良好的效果，抗体水平比异源苗高2倍～4倍，免疫期亦长2倍～4倍，但CPV灭活苗不能刺激犬体产生足够的胃肠道局部抗体，呈隐性带毒状态，成为犬群的传染源。

6.3　基因工程疫苗

随着分子生物技术的不断发展，研究人员希望借助分子生物技术手段，寻求更安全有效的疫苗，以弥补常规灭活苗和弱毒苗存在的种种不足。国内外的相关研究很多，基因工程疫苗及核酸疫苗的研究已取得了较大的进展。用含CPV的VP1基因真核表达质粒免疫犬，攻毒保护试验证明基因疫苗能够保护犬不被CPV感染；在昆虫杆状病毒表达系统中表达了CPVVP2蛋白，10μg的表达蛋白可使犬获得良好的免疫效果；杨玲等用大肠埃希菌成功表达了CPV的VP2基因，并对其表达产物进行了初步研究，结果表明，该表达产物能诱导机体的产生中和抗体，为基因工程疫苗的进一步研制提供了有益的参考价值。陈同海等应用赵福广构建的pcDCPV和pIRcpvIL2重组质粒配制成疫苗，对幼貉进行免疫，结果表明，用pcDCPV和pIRcpvIL2重组质粒免疫后的幼貉对细小病毒的攻击具有一定的保护作用；谢之景等用PCR方法扩增犬CPV貉分离株(PV/貉/CC/1/86)的VP2 蛋白基因，将其克隆入真核表达载体pVAX1 的CMV 启动子的下游， 构建了CPV核酸疫苗的真核表达质粒pVCPV，pVCPV 转染BHK-21细胞能够表达CPV VP2 蛋白， 所表达的CPV VP2蛋白能够与抗CPV 的阳性抗体发生特异性的抗原- 抗体反应。免疫接种小鼠，能够诱导机体产生抗CPV的特异性体液免疫和细胞免疫。郑颖等根据CDV的H基因、CPV的VP1基因、犬2型腺病毒(CAV-2)F基因的核苷酸序列，用PCR或RT-PCR方法扩增克隆目的基因，分别构建了pIRCDV-H、pIRESVP1和pcCAV-F3个真核表达质粒并进行了序列验证，用3种免疫质粒经纯化后混合对15只犬进行免疫，所有接种混合基因疫苗的犬，2次免疫后即可产生较高的抗体水平，攻毒后大部分犬能抵抗3种强毒的攻击，对照犬发病严重，证明所构建的CDV、CPV、CAV三联DNA疫苗在一定程度上可抵抗强毒的攻击。谢之景等对CAV-2的E3区的Ssp I片段进行缺失构建了E3区缺失载体pVAXΔE3，然后将CPV VP2表达盒连接到pVAXΔE3的E3区缺失处，构建了CPVVP2表达盒的转移载体pΔECPV-VP2，用SalⅠ＋NruⅠ分别对pPoly-2CAV2和pΔECPV-VP2进行双酶切，分别进行琼脂糖凝胶电泳回收目的片段，将含CPVVP2表达盒的SalⅠ＋ NruⅠ片段定向克隆入pPoly-2CAV-2载体，获得了含CPVVP2表达盒重组CAV-2基因组的质粒pCAV-2/CPV-VP2。用AscⅠ＋ClaⅠ对pCAV-2/CPV-VP2进行双酶切，释放CAV-2/CPV-VP2重组基因组，将CAV-2/CPV-VP2基因组与去除SalⅠ＋NruⅠ片段的CAV-2基因组的两个片段混合，利用脂质体介导共转染DK细胞，出现病变，获得重组病毒CAV-2/CPV。Andrea Molina等将CPVVP22L21抗原决定族与霍乱毒素B亚单位融合后在转基因烟草叶绿体中表达，构建了亚单位疫苗，可有效诱导体液免疫，但口服给予免疫效果有待提高。而且口服途径给予也是DNA疫苗今后的主要发展方向。

7　CPV的检测

由于很多疾病都会引起犬的呕吐、腹泻，所以通过临床观察很难确诊CPV感染，目前已经建立的检测方法有很多种，有的针对病毒蛋白，有的针对病毒核酸，如电镜、病毒分离(VI)、乳胶凝集试验、血凝试验(HA)、血凝抑制试验(HI)、原位杂交、酶联免疫吸附试验(ELISA)、聚合酶链反应(PCR)等。CostantinaDesario等对其中的几种方法(IC、HA、VI、常规PCR和实时PCR)进行了比较。电镜病毒分离敏感、特异性强，但费时且花费成本较高；凝集试验虽然快速，但敏感性低；HA需和HI配合使用，且需使用新鲜的猪红细胞(常用)，不太方便；ELISA既可检测抗原，也可检测抗体，便利、快速、敏感、特异性强，其敏感性略低于电镜，而且不能分辨野毒感染或是疫苗免疫效果，当免疫犬感染其他病，其临床症状与CPV相似时，就会出现假阳性反应；随着分子生物学技术的发展，特别PCR技术的成熟，为CPV的检测提供了更为有效可靠的方法，PCR包括套式PCR、降落PCR、原位PCR、特异等位基因PCR、PCR诊断试剂盒、实时PCR等，有的基于单克隆抗体，有的利用多克隆抗体。PCR检测敏感性高，特异性强，可分辨野毒感染和疫苗免疫，尤其是结合2h～4h即可检测出病毒核酸，但其对设备要求较高，对于基层工作者相对困难；近年来，随着胶体金免疫层析方法的进一步发展，利用胶体金标记单克隆CPV表面抗体，制成检测CPV抗原的胶体金检测试纸也开始应用于兽医临床。该方法敏感性高，特异性强，稳定性好，操作简便快速，结果易于分析判定。核酸探针技术如MGB探针试验也是应用于检测CPV的一种分子生物学技术，可区别疫苗毒和野毒。此外，环介导等温扩增(LAMP) 是一种比较新颖、敏感、快捷的方法，仅需1h，结果可用肉眼观察，与PCR相比，敏感性为100%，特异性为76.9%LAMP的最低检出量为10－1TCID50/mL，而PCR最低检出量为10TCID50/mL。