摘 要：猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的糖蛋白GP5含有中和表位，是检测用抗原和亚单位疫苗的首选蛋白。本研究将糖蛋白GP5基因截短后，克隆至表达载体pET-30a，转化大肠埃希菌，经IPTG诱导后，SDS-PAGE电泳显示重组蛋白以包涵体形式得到了表达，每升重组菌可纯化得到目的蛋白87.5mg。Western blot和间接酶联免疫吸附试验分析表明，该蛋白与PRRSV阳性血清具有良好免疫反应性。
关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒；结构蛋白GP5；免疫反应性
猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratorysyndrome virus，PRRSV)引起的一种以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道症状为特征的传染病。PRRSV为动脉炎病毒属有囊膜的单链正股RNA病毒，含有3个主要结构蛋白，分别是由ORF5编码的糖蛋白(GP5)，由ORF6编码的基质蛋白(M)和由ORF7编码的核衣壳蛋白(N)。GP5蛋白与病毒的感染力有关，含有重要的与病毒中和活性相关的功能域，能诱导机体产生中和抗体。M蛋白与细胞免疫有关。N蛋白诱导机体产生的抗体出现的时间最早、效价高，但这种抗体不具有中和活性。目前，常用的检测PRRSV抗体的试剂盒主要以N蛋白为包被抗原，检测结果并不能反应临床猪群的免疫保护水平。因此，探索一种能够检测血清中PRRSV中和抗体的方法是非常必要的。本研究应用原核表达系统以融合蛋白的形式对GP5基因进行截短表达，并对其抗原位点与表达产物的免疫反应性进行分析，为PRRSV-GP5蛋白作为诊断抗原的研究提供借鉴。
1 材料与方法
1.1 菌株与质粒
大肠埃希菌Rosetta菌株，含北美洲型PRRSVGP5基因的重组质粒，pMD18-T-GP5原核表达载体质粒和pET30a由浙江省微生物与食品安全重点实验室保存。
1.2 酶类和试剂
限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ，DNA Marker DL 2 000均购自宝生物工程(大连)有限公司；supTaqdNTPMix购自上海申能博采生物科技有限公司；DNA琼脂糖胶回收试剂盒及DAN连接试剂盒等购自上海生工生物技术服务有限公司；预染蛋白分子Marker购自晶美生物工程有限公司；卡那霉素、IPTG购自鼎国生物工程公司；镍琼脂糖凝胶FF柱购自北京卓冠科技有限公司。ELISA抗体检测试剂盒购自美国爱德士(IDEXX)生物科技公司。
1.3 血清
血清为经IDEXX ELISA抗体检测试剂盒检测的阴、阳性血清。
1.4 表达载体的构建
1.4.1 GP5序列分析 用分子生物学软件DNA Star中的MEGALIGN5.0对浙江省微生物与食品安全重点实验室分离到的15株PRRSV的GP5基因进行核甘酸序列的比对和同源性分析。
1.4.2 抗原表位的分析 利用Signal P3.0网站(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)和TMHMM Serverv.2.0网站(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0)对已知的GP5氨基酸序列进行分析。并借助DNAsis2.5软件对其疏水性进行分析。
1.4.3 引物设计与合成 根据序列分析结果设计引物，扩增除去信号肽和跨膜区的截短GP5片段。
分为A和B两部分，其中扩增A片段的引物为：FA：ACGGATCCGCCAGCAACAACAACAGCTC；RA：GCCTCCTGGTCCAGTCTCCACTGCCCAG，扩增B片段的引物为：FB：GGACCAGGAGGCAGGCTTGCGAAGAACTGCAT，RB：AACTCGAGCTAGAGACGACCCCATTGTT。其中，横线所标注部分为引入的酶切位点，波浪线标注部分为引入的柔性linker融合片段。
1.4.4 截短GP5基因的融合PCR扩增与重组表达质粒的构建 PCR扩增GP5基因A片段和B片段条件一致：1μL重组质粒pMD18-T-GP5,5 μL 10×pfu PCR缓冲液，0.2 mmol/L dNTP，引物各1μmol/L，2.5U pfuTaqplus。PCR反应条件为：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s,54 ℃ 30 s,72 ℃ 15 s，30个循环；72℃延伸10 min。PCR融合A和B两部分，50 μL的PCR反应体系包括A和B的PCR产物各1 μL,5 μL 10×pfuPCR缓冲液，0.2 mmol/L dNTP，FA和RB引物各1 μmol/L,2.5 U pfuTaqplus。PCR反应条件为：94 ℃ 3 min；80 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s，72 ℃ 35s,30个循环；72 ℃延伸10 min。割胶回收纯化的PCR产物，用BamHⅠ/XhoⅠ双酶切，与经同样酶双酶切的质粒pET-30a连接，热休克法转化感受态大肠埃希菌Rosetta菌株，经过PCR和测序鉴定，获得阅读框正确的重组表达载体pET30a-GP5。
1.5 截短GP5基因在大肠埃希菌中的表达
挑取单菌落接种于5 mL含100 μg/mL Kanamycin的LB培养基中，过夜培养。取200 μL培养液接种于20mL含同样浓度抗生素的LB培养基，37 ℃培养至OD600值达0.6，加入终浓度为1 mmol/L的IPTG，继续培养4 h～5h后收集细菌，同时培养诱导含空载体pET30a的转化菌，表达产物用SDS-PAGE检测。
1.6 表达产物的纯化
经可溶性分析后确定目的蛋白主要存在于沉淀中，用8mol/L尿素溶解经超声裂解后的细菌沉淀，用Ni-NTAAgarose柱变性纯化，用含50 mmol/L咪唑的PBS(50mmol/L，pH 8.0)洗去杂蛋白，用含400 mmol/L咪唑的PBS洗脱目的蛋白。纯化后的蛋白用Bradford法测定浓度。
1.7 免疫印迹分析GP5蛋白的反应原性
将SDS-PAGE电泳凝胶的蛋白带转移至PVDF膜，用含50g/L脱脂奶粉的TBST封闭，以PRRSV阳性血清为一抗，HRP标记的金葡菌A蛋白为二抗做免疫印迹，4-氯-1-萘酚(4-CN)显色。
1.8 ELISA分析GP5与免疫血清的反应原性
将PRRSV阳性血清(PC)和阴性血清(NC)进行倍比稀释，在包被有倍比稀释已知浓度的GP5纯化蛋白的酶标板中进行ELISA方阵测定，确定最佳抗原包被浓度与血清稀释倍数。每孔加入的包被抗原与稀释血清的体积均为100μL，血清稀释液中加5%大肠埃希菌裂解液以阻断非特异性反应。二抗为HRP标记的金葡菌A蛋白(SPA)，用底物邻苯二胺(OPD)显色，酶标仪测定OD492值。并用此抗原对10份经美国IDEXX公司的PRRSV抗体检测，试剂盒检测为阳性的血清进行比较试验。
2 结果
2.1 GP5基因同源性分析
根据浙江省微生物与食品安全重点实验室对华东地区15株PRRSV的序列分析可知，2007年流行于本地区的PRRSVGP5基因的同源性为97.2%～100%。
2.2 抗原表位的分析
通过对该GP5的疏水性、信号肽序列预测可知：信号肽序列分布于GP5的前31位氨基酸处，跨膜区的位置分别位于15～32、66～88和103～125位氨基酸之间，而本研究中所要表达的蛋白质区域是具有较强亲水性的A和B两部分的融合片段(图1)。X轴表示不同的氨基酸残基数，Y轴表示平均疏水值。箭头所标明的分别是信号肽序列和融合表达的蛋白区域(A和B)。灰色线条包围区域为3个跨膜区(TM1，TM2和TM3)。
图1 PRRSV GP5疏水性分析
Fig.1 Schematic depiction of hydrophobicity profile ofPRRSV GP5
2.3 GP5基因的PCR扩增与重组表达质粒的构建
以重组质粒pMD18-T-GP5为模板，用相应引物进行PCR扩增后，在10g/L琼脂糖凝胶上进行电泳，可见与预期大小一致的A条带(128 bp)，B条带(248 bp)，融合片段AB(364bp)(图2)。经PCR鉴定阳性的克隆pET30a-GP5再经测序鉴定，用DNA Star软件分析显示全长364bp的GP5基因与载体上的6His融合，且阅读框正确。
M.DNA标准DL 2 000；1.A片段PCR扩增产物；2.B片段PCR扩增产物；3.A和B片段的融合PCR扩增产物
M.DNA Marker DL 2 000；1.Fragment A；2.Fragment B；3.Fusion fragmentof A and B
图2 GP5基因的PCR扩增
Fig.2 PCR amplification of the GP5 gene fragment
2.4 表达产物GP5的纯化
重组菌经超声处理后离心，沉淀用8 mol/L尿素溶解，经Ni-NTAAgarose柱变性纯化，再经SDS-PAGE检测(图3)，在相对分子质量约19.2ku处可见纯化的GP5蛋白。纯化产物用Brandford法测定浓度，推算出每升重组菌可纯化得到目的蛋白87.5 mg。
2.5 融合表达产物GP5的SDS-PAGE与免疫印迹检测
SDS-PAGE分析结果显示，含重组质粒pET-30a-GP5的诱导菌出现相对分子质量约19.25ku的融合蛋白条带，与理论推测结果一致。Westernblot分析结果表明，融合表达产物与PRRSV阳性血清具有良好的免疫反应性(图3)。
1.蛋白分子质量标准；2.纯化后的GP5
1.Protein molecule weight Marker；2.Purified GP5
图3 GP5截短蛋白的SDS-PAGE(A)与Western blot(B)检测
Fig.3 SDS-PAGE (A) and western blot (B) analysis of truncated GP5fusion protein
2.6 ELISA分析GP5与免疫血清的反应原性
经方阵法测定，当抗原稀释度为5 μg/mL，血清稀释倍数为1∶100时，阴、阳血清OD492值差异明显，此时阳性血清的OD值在2.0左右，阴性的OD值在0.2左右。用IDEXX公司的PRRSV抗体检测试剂盒检测的9份阳性血清中，除1份反应性较低外(OD值0.1635)，其余均表现出较好的免疫反应性(图4)。
1.阴性血清；2～10.阳性血清
1.Negative serum；2-10，Positive serum samples
图4 GP5截短蛋白与PRRSV阳性血清的免疫反应性分析
Fig.4 Immunoreactivity of truncated GP5 protein with PRRSV positiveserum samples as determined by ELISA
3 讨论
PRRS广泛流行于世界各国养猪业，引起很大的经济损失。研究开发有效疫苗防治此病的发生固然重要，而建立良好的免疫效果监测手段也十分必要。
GP5蛋白因其具有中和抗原表位而成为亚单位疫苗和检测抗原的候选蛋白。但在其N末端有信号肽序列，这段序列的主要作用是引导新合成的多肽定位到内质网上，之后会被剪切掉，它与GP5的抗原性无关。此外，GP5还含有3段疏水性较强的跨膜区。研究表明，缺失信号肽和跨膜区的GP5不仅有较好的反应原性，而且也能获得较高的表达量。并且在其37位～45位氨基酸为核心的区域内存在着中和抗原表位。本研究利用融合PCR方法，截去了GP5基因的信号肽和3个跨膜区域，并在两个片段之间加入了柔性连接序列。结果表明，此截短的GP5基因在大肠埃希菌中得到了高效表达；Westernblot和ELISA分析表明，重组GP5蛋白能和PRRSV阳性血清反应，具有良好的反应原性。但是，在ELISA结果中，GP5蛋白与6号血清反应的OD值较低，一是该血清可能不含有抗GP5蛋白的抗体，即不具有中和病毒的活性，二是原核表达可能会影响GP5蛋白的构象，从而影响与血清的反应性。本研究结果为截短GP5融合蛋白用于PRRSV中和抗体水平的监测提供了基础。
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