J亚群禽白血病病毒gp85基因的克隆与表达

摘　要：构建J亚群禽白血病病毒gp85基因的原核表达载体，并在大肠埃希菌中获得表达。根据原核表达载体pET30的酶切图谱设计引物，以重组质粒pBS-T-env为模板，扩增gp85基因。将此段基因克隆到表达载体pET30上，转化大肠埃希菌BL21，用IPTG诱导表达，经SDS-PAGE分析，表达出约为70ku的融合蛋白。获得了gp85基因的表达产物，为研制ALV-J的特异性抗血清及国内ALV-J病毒分子诊断试剂盒奠定了基础

关键词：J-亚群禽白血病病毒；gp85基因；克隆；表达

J亚群禽白血病(Avian leukosis subgroup J)是由J亚群禽白血病病毒(Avian leukosis virussubgroupJ，ALV-J)引起的一种肿瘤性疾病。该病毒感染率高，发病率低，可通过水平和垂直两种方式传播感染鸡群。20世纪80年代末，PayneL N等首次从肉用型鸡群中分离并鉴定出新型的外源性J亚群禽白血病病毒。该病在世界各国均有不同程度流行，给世界养禽业造成了严重的经济损失。BaiJ等通过对ALV-J遗传结构的分析，得出ALV-J的囊膜蛋白基因与禽内源性反转录病毒的囊膜蛋白基因有97%以上的同源性，表明ALV-J是外源性ALV和内源性E亚群的基因重组变异株。它不属于禽ALV已知亚型中的任何一群，被单独命名为ALV-J亚型。与其他反转录病毒的env基因一样，由于病毒RNA的复制缺乏校对机制，ALV-J的env基因极易突变。ALV-J基因组主要含有3个基因，即gag、pol和env。其亚群特异性主要由env基因编码的表面囊膜蛋白gp85决定。ALV-J的gag和pol基因相对保守，而包括gp85在内的env基因存在着较大的变异。

对ALV-J的诊断主要是检测抗原。国外的抗原检测试剂盒已经商品化，主要是双抗体夹心ELISA，但价格昂贵、种毒与国内毒株一致性差。国内常用琼脂扩散试验(AGP)、补体结合试验、PCR等，检测的灵敏性、特异性都不是很好，不适合大量样品的检测，ELISA诊断仍处于研制的初级阶段，不能投入商品化应用。因此，国内急需开展该试剂盒的研究并使之商品化。为解决这一问题，本研究旨在对ALV-J鉴定的基础上，进行ALV-JNX0101毒株gp85基因的克隆与表达。尝试应用gp85基因的表达产物作为抗原来制备ALV-J的特异抗血清，以期为国内ALV-J分子诊断试剂盒的研制提供理论依据。

1　材料与方法

1.1　病毒和细胞

J亚群禽白血病病毒NX0101株，山东农业大学崔治中教授惠赠。SPF鸡胚来源于中国兽药监察所SPF动物实验室。鸡胚成纤维细胞(CEF)按常规方法制备。

1.2　主要试剂

TaqDNA Polymerase、限制性内切酶EcoRⅠ、SalⅠ、T4 DNA连接酶、DNA Marker λHindⅢ、DL 2000购于宝生物工程(大连)有限公司。克隆用载体质粒pBS-T、大肠埃希菌感受态DH5α、BL21(DE3)购于天根生化科技有限公司。pET30表达质粒为北京市农林科学院畜牧兽医研究所实验室保存。

1.3　引物的设计与合成

根据已扩增env基因的测序结果，设计引物P1：5′-CGGAATTCGGGGAGTTCATCTAT-3′，5′端加入EcoRⅠ位点，P2：5′-CGTCGACACTCCATAGCTGTAGCTCA-3′ ,5′端加入SalⅠ位点，用于表达gp85基因。P1、P2之间为完整的gp85基因阅读框。引物由英骏生物技术有限公司合成。

1.4　gp85基因的扩增

以鉴定为阳性的pBS-T-env质粒DNA为模板，P1、P2为引物，扩增NX0101株ALV-J的gp85基因。反应条件：95 ℃ 5min；95 ℃ 1 min，52 ℃ 1 min，72 ℃ 40 s，进行30个循环；最后72℃ 8 min。PCR产物用8g/L的琼脂糖凝胶进行电泳检测。

1.5　重组表达载体pET30-gp85的构建

1.5.1　表达载体的构建　PCR产物经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切，酶切产物用试剂盒回收，同样方法处理质粒pET30。将二者用T4DNA连接酶进行连接，连接产物转化大肠埃希菌感受态细胞DH5α，用Kna筛选阳性菌落。

1.5.2　阳性表达载体的鉴定　碱法小量提取质粒作为模板，用P1、P2引物对重组质粒进行PCR及酶切鉴定。鉴定为阳性的质粒样品送英骏生物技术有限公司测序。

1.6　目的基因在大肠埃希菌中的表达

按常规方法从含重组质粒pET30-gp85的大肠埃希菌DH5α中抽提质粒。然后，将其转化受体菌BL21(DE3)，挑取单克隆的大肠埃希菌，用IPTG (终浓度为1mmol/L)诱导表达，设pET30空载体作为阴性对照。将诱导表达产物经12 g/L SDS-PAGE电泳鉴定。

2　结果

2.1　NX0101株env-gp85基因的PCR扩增

以鉴定为阳性的pBS-T-env质粒DNA为模板，P1、P2为引物，扩增NX0101株ALV-J的gp85基因，经8g/L琼脂糖凝胶电泳检测，可见980 bp左右的清晰条带，与预期片段大小相符(图1)

1.gp85基因的PCR扩增产物；2.DNA标准DL 2 000

1.PCR products of gp85 gene；2.DNA Marker DL 2 000

图1　gp85基因的PCR扩增结果

Fig.1　PCR amplification products of gp85 gene

2.2　表达质粒pET30-gp85的鉴定结果

用EcoRⅠ和SalⅠ双酶切重组质粒pET30-gp85，经8 g/L琼脂糖凝胶电泳，可见清晰的980 bp和5 422bp两条带，与预期片段大小相符(图2)

1.DNA标准DL 2 000；2. pET30-gp85的PCR产物；3. pET30-gp85经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切产物；4. DNA标准λHindⅢ

1.DNA Marker DL2 000；2.PCR products of pET30-gp85；3.Products ofpET30-gp85 digested byEcoRⅠandSalⅠ；4.DNA MarkerλHindⅢ

图2　表达质粒pET30-gp85的PCR及酶切鉴定结果

Fig.2　Identification of the expression plasmid pET30-gp85 by PCRand enzyme digestion

2.3　重组质粒pET30-gp85表达产物的SDS-PAGE结果

重组质粒pET30-gp85转化BL21大肠埃希菌的表达产物在蛋白分子质量约70ku左右显示出清晰的条带，而阴性对照非重组的pET30质粒表达产物没有显示相应的条带(图3

1.未诱导的空载体pET30；2.IPTG诱导5h后的空载体pET30；3.未诱导的重组质粒pET30-gp85；4～7.分别为IPTG诱导2、4、5、6h后的重组质粒pET30-gp85；8.蛋白分子质量标准

1.Uninduced pET30；2. pET30 induced with IPTG for 5 h；3.UninducedpET30-gp85；4-7.pET30-gp85 induced with IPTG for 2、4、5、6 h；8.Proteinmolecular weight marker

图3　重组质粒pET30-gp85表达产物的SDS-PAGE电泳结果

Fig.3　SDS-PAGE of expressed products of recombinant plasimidpET30-gp85

3　讨论

到目前为止，对AL-J还没有切实可行的治疗措施，也没有完全有效的疫苗可供使用。采用诊断检测并淘汰阳性种鸡，是控制该病的主要措施。这就需要适用于大型鸡群的常规诊断方法，由于ALV-J的亚型特异性是由env基因编码的gp85蛋白决定，因此，建立特异性检测ALV-J囊膜蛋白gp85的诊断方法已成为研究热点。虽然国外特异性检测ALV-J囊膜蛋白gp85的试剂盒已商品化，但由于gp85存在着极为普遍的抗原变异，世界各地ALV-J分离株gp85的分子变异规律也各不相同，因此不能保证来自国外的试剂盒在中国使用能具有良好效果，而且其价格昂贵，很难大范围使用。

原核表达系统具有成本低和表达量高的特点，已广泛应用于诊断试剂、疫苗生产和蛋白质功能研究等方面。本试验考虑到gp85两侧引物可以扩增CEF细胞基因组中的内源性序列，采用了含有ALV-JNX0101株gp85基因的重组质粒pBS-T-env为模板，扩增gp85基因，以避免非特异性扩增。克隆的gp85基因，采用pET30表达系统，在大肠埃希菌BL21中进行表达，通过蛋白质电泳技术，检测gp85基因的表达产物，尝试用亲和层析法纯化gp85蛋白作为抗原，制备特异性ALV-J抗血清，以期为研制国内J亚群禽白血病ELISA诊断试剂盒，有效控制和净化J亚群禽白血病奠定基础