摘 要：从猪萎缩性鼻炎(AR)临床症状猪群分离出34株疑似支气管败血波氏杆菌(Bb)，对分离菌进行形态结构、染色特性、培养性状和生化特性等方面的测定，结果这些分离菌均符合Bb的生物学特征；对BbFlaA基因进行PCR扩增，所有分离菌均能扩增出特异性DNA条带，与传统方法的鉴定结果完全一致，且最小检出量为0.64pg；而猪鼻腔和肺组织中常见的多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、变形杆菌及枯草芽孢杆菌均未出现任何DNA条带。药敏试验显示，这些分离物对多黏霉素B、丙氟哌酸、氟哌酸、卡那霉素和庆大霉素均表现高度敏感。
关键词：猪萎缩性鼻炎；支气管败血波氏杆菌；分离鉴定；PCR；药敏试验
猪萎缩性鼻炎(Atrophic rhinitis of swine，AR)又称猪传染性萎缩性鼻炎(Infectionsatrophic rhinitis of swine，IAR)，是由支气管败血波氏杆菌(Bordetellabronchiseptica，Bb)或产毒素多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida，Pm)引起的一种慢性接触性呼吸道传染病。本病以鼻塞、打喷嚏、流鼻血、咳嗽、呼吸不畅、颜面变形或鼻梁歪斜为主要特征。哺乳仔猪感染本病后，除主要特征外，还可以引起全身钙、磷代谢障碍，致使仔猪发育迟缓，饲料利用率降低，有时伴发急、慢性支气管炎，导致仔猪死亡，从而给养殖业带来严重的经济损失。
AR于1830年由德国学者Frangue首次报道。近几十年来，随着集约化养猪业的不断发展以及猪的引种和频繁调运，本病己经广泛分布于世界各养猪业发达地区。2003年－2006年，贵州省6个养猪场先后出现了疑似AR的病例，为查明病因，采集这些感染猪群鼻腔棉拭子156份进行分离，获得了34株疑似Bb分离菌。本试验对分离菌进行了形态结构、染色特性、培养性状和生化特性等方面的生物学测定，同时针对BbFlaA基因合成一对特异引物进行PCR鉴定及药敏试验，现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株来源 34株疑似Bb分离菌(编号为B1、B2、……、B34)，分离自表现AR临床症状的6个养殖场猪群；多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、变形杆菌和枯草芽孢杆菌，为贵州大学动物科学学院实验室冻干保存菌株。
1.1.2 主要试剂 细菌培养基、生化反应试验管、药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司；PCR试剂、200 bpMarker、EB为上海生工生物工程技术服务有限公司产品。
1.2 方法
1.2.1 形态结构与染色特性测定 取34株疑似Bb分离物接种10g/L葡萄糖麦康凯培养基，挑取单个菌落染色镜检，观察细菌分离物的形态结构；采用压滴法、硝酸银和节思明染色法分别观察细菌的运动性、鞭毛和荚膜。
1.2.2 培养性状与生化特性测定 取上述细菌分离菌分别接种10g/L葡萄糖改良麦康凯琼脂平板、鲜血琼脂平板、胰蛋白胨大豆琼脂平板及普通营养琼脂平板等，同时接种各种生化反应管，置37 ℃温箱培养24h～48 h，观察结果。
1.2.3 PCR鉴定
1.2.3.1 引物设计 参照Hozbor D等报道，针对BbFlaA基因上游序列选择合成1对引物，即Fla1：5′-TGGCGCCTGCCCTAT-3′和Fla2：5′-AGGCTCCCAAGAGAGAAAGGCTT-3′，其理论扩增幅度为237bp，由上海生工生物工程技术有限公司合成。
1.2.3.2 PCR扩增 将分离菌分别接种到胰蛋白胨大豆琼脂平板上，37 ℃培养24 h，挑取单个菌落，放入2 mL离心管，以每50μL双蒸水一个菌落计，混匀后100 ℃煮沸10 min，冰块中冷却10 min,4 ℃10 000 r/min离心10min，取上清液作为模板。PCR反应体系为30 μL：双蒸水21.5 μL、10×buffer缓冲液(含15 mmol/L MgCl2) 3 μL、TaqDNA聚合酶1 μL、dNTP0.5 μL、引物Fla1和Fla2各(10 μmo/L) 1.5 μL、模板1μL。PCR反应条件为：95 ℃5 min；94 ℃ 30 s,56 ℃30 s,72 ℃40 s,35个循环；最后72 ℃10min。取PCR产物5 μL，于20 g/L琼脂糖凝胶电泳，EB染色，凝胶成像系统观察。
1.2.3.3 PCR特异性与敏感性试验 按上述方法分别提取多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、奇异变形杆菌和枯草芽孢杆菌的DNA模板进行PCR反应，检测PCR特异性；Bb菌株菌液DNA为模板经10倍连续稀释后，取各浓度进行PCR扩增，检测PCR的敏感度，同时按照常规方法进行细菌计数。
1.2.4 药物敏感性试验 按常规纸片法测定Bb分离菌对12种抗生素的敏感性。
2 结果
2.1 形态结构与染色特性
经抺片、染色镜检，34株细菌分离物均为G－的短小杆菌，多呈单或成双排列，少数成短链状，不形成芽胞；压滴法可观察到细菌具有运动性，经硝酸银染色后，可见细菌有周鞭毛；节思明染色后发现细菌分离物有荚膜。
2.2 培养性状和生化鉴定
在10 g/L葡萄糖改良麦康凯琼脂平板，34株细菌分离物均能耐受5g/L胆盐抑制剂，发育为无色或茶黄色菌落；在鲜血琼脂平板上，所有菌均呈β溶血；在胰蛋白胨大豆琼脂平板上，所有菌呈无色、大小不等的菌落；在普通营养琼脂平板上，所有菌于24h后可见针尖样小菌落，48h即获得茂盛生长。所有分离物不能分解碳水化合物，即葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、木糖、果糖试验均为阴性，而过氧化氢，尿素酶、硫化氢，石蕊牛乳等试验均为阳性，能利用柠檬酸盐，还原硝酸盐，吲哚及MR反应阴性。
根据细菌分离菌的形态结构、染色特性、培养性状和生化鉴定等结果，34株分离菌均符合Bb的生物学特征。
2.3 PCR鉴定
经Fla1/Fla2引物进行PCR反应，34株分离菌均扩增出一条约为240bp的特异DNA条带(图1和图2)，与引物设计的预期片段大小一致。
1～17.B1～B17；M.200 bp标准；N.空白对照
1-17.B1-B17；M.200 bp Marker；N.Blank control
图1 分离菌株B1～B17的PCR检测结果
Fig.1 The PCR results of B1-B17 isolates
18～34.B18～B34；N.空白对照；M.200 bp标准
18-34.B18-B34；N.Blank control；M.200 bp Marker
图2 分离菌株B18～B34的PCR检测结果
Fig.2 The PCR results of B18-B34 isolates
2.4 PCR特异性与敏感性试验结果
分别提取Bb、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、变形杆菌和大肠埃希菌等猪鼻腔和肺组织中常见细菌的DNA样本进行PCR，结果只有Bb扩增出一条大小约为240bp的特异DNA条带，其他菌均未扩增出任何DNA条带(图3)。
M.200 bp标准；N.空白对照；1.多杀性巴氏杆菌；2.金黄色葡萄球菌；3.枯草芽孢杆菌；4.铜绿假单胞菌；
5.大肠埃希菌；6.Bb菌株；7.变形杆菌
M.200 bp标准；N.空白对照；1.10－2；2.10－3；3.10－4；4.10－5；5.10－6；6.B.bronchiseptica；7.P.mirabillis
图3 PCR特异性检测结果
Fig.3 Specificity of PCR results
将Bb分离株不同稀释度即10－2、10－3、10－4、10－5和10－6菌液进行PCR扩增，结果稀释度为10－4的菌液在PCR扩增后可出现明显的DNA条带(图4)。根据含菌量测定结果和文献资料推算，10－4菌液的DNA含量为0.64 pg，即该PCR的最小检出量为0.64 pg。
M.200 bp Marher；N.Blank control；1.10－2；2.10－3；3.10－4；4.10－5；5.10－6
M.200 bp Marher；N.Blank control；1.P.multocida；2.S.aureus；3.B.subtilis；4.P.aeruginosa；5.E.coli；
图4 PCR敏感性检测结果
Fig.4 Sensitivity of PCR results
2.3 药敏试验
34株Bb分离物对12种抗菌素的敏感性见表1。
表1 34株细菌分离物的药敏试验结果
Table 1 The drug sensitivity test results of 34bacterial isolates
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抗菌药物
Antimicrobial drugs
|
纸片药物含量
/(μg·片－1)
Drug concentration
|
判定标准
Criteria
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||
|
耐药
Drug resistance
|
中敏
Middle sensitive
|
高敏
High sensitive
|
|
||
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先锋霉素
VPioneer adriamycin V
|
30
|
≤14
|
15-17
|
≥18
|
|
|
多黏菌素
BPolymyxin B
|
300u
|
≤7
|
8-10
|
≥11
|
|
|
丙氟哌酸
C Norfloxacin
|
5
|
≤15
|
16-20
|
≥21
|
|
|
氟哌酸
Norfloxacin
|
10
|
≤12
|
13-16
|
≥17
|
|
|
利福平
Rifanpicin
|
5
|
≤16
|
17-19
|
≥20
|
|
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青霉素
Penicillin
|
10u
|
≤28
|
―
|
≥29
|
|
|
卡那霉素
Kanamycin
|
30
|
≤13
|
14-17
|
≥18
|
|
|
庆大霉素
Gentamicin
|
10
|
≤12
|
13-14
|
≥15
|
|
|
四环素
Tetracycline
|
30
|
≤14
|
15-18
|
≥19
|
|
|
红霉素
Erythromycin
|
10
|
≤13
|
14-22
|
≥23
|
|
|
氯洁霉素
Chlorine lincomycin
|
2
|
≤14
|
15-20
|
≥21
|
|
|
链霉素
Streptomycin
|
10
|
≤11
|
12-14
|
≥15
|
|
从表1可见，34株Bb分离株对多黏素B、丙氟哌酸、氟哌酸、卡那霉素和庆大霉素表现高度敏感，而对先锋霉素、利福平、青霉素、四环素、红霉素、氯洁霉素和链霉素表现不同程度耐药性。
3 讨论
从表现AR临床症状猪群中采取156份鼻腔棉拭子进行细菌学的分离鉴定，结果分离出34株Bb，分离率为21.8%。
根据BbFlaA基因上游序列选择合成一对特异性引物(Fla1/Fla2)，对34株分离株进行PCR鉴定，结果34株均扩增出一条大小约为240bp的特异DNA条带，与传统的生理生化鉴定结果完全一致。且最小检出量为0.64pg；对猪鼻腔和肺组织中常见的多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、变形杆菌和枯草芽胞杆菌均呈阴性反应；说明该PCR方法具有较高的特异性和敏感性，与传统的细菌学鉴定方法比较，具有特异、敏感、简便、快速等特点，可用于AR病原(Bb)的临床鉴定。
临床上根据药物敏感性试验，可以给生产实践提供用药依据。本试验中34株Bb分离株对多黏霉素B、丙氟哌酸、氟哌酸、卡那霉素和庆大霉素表现高度敏感，对链霉素等表现耐药；而边传周等报道对庆大霉素表现耐药；韩洪伟等报道对链霉素表现高度敏感。其差异性表现在细菌对抗生素很容易产生不同程度的耐药性，尤其是长时间应用抗生素的猪，因此建议临床上交叉使用药物。为了更好地控制本病，应采用综合防控措施，即疫苗接种为主，再辅以药物防治，同时加强饲养管理。
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