摘 要：细胞凋亡是生物界广泛存在的一种重要的生命过程，是多细胞动物为调节机体发育、维护内环境稳定、有基因调控的细胞主动性死亡过程。在细胞凋亡的分子生物学研究过程中，发现已有多种基因参与细胞凋亡的调控，其中包括Bcl-2家族和Bax、p53、Fas和FasL等。家禽免疫器官胸腺、脾脏和法氏囊内存在着自然凋亡现象，许多学者用物理性、化学性和生物性因素诱导了家禽免疫器官细胞凋亡，证实了细胞凋亡相关基因参与了家禽免疫器官内细胞凋亡的调控。
关键词：细胞凋亡；凋亡相关基因；免疫器官；家禽
细胞凋亡是生物界广泛存在的一种重要的生命过程，是多细胞动物为调节机体发育、维护内环境稳定、有基因调控的细胞主动性死亡过程。目前普遍认为它与细胞分裂、细胞分化类似，受细胞内多种基因的控制，是一个级联式(cascade)基因表达的结果。在细胞凋亡的分子生物学研究过程中，发现已有多种基因参与细胞凋亡的基因调控，其中包括Bcl-2、p53、ced、c-myc、ICE、Fas/Apo等。
细胞凋亡或程序性细胞死亡可被多种内源性(细胞所属整体的其他细胞的信号)或外源性(化学、物理及生物学因素)因素所诱导。大部分细胞凋亡和程序性死亡的诱导物浓度过高时，亦可引起细胞坏死，迅速分化中的细胞特别容易被诱导。许多学者用外源性因素诱导了家禽免疫器官细胞凋亡，如热应激、病原微生物等，并探讨了凋亡基因的表达与细胞凋亡之间的关系。
1 家禽免疫器官内细胞自然凋亡及其基因调控
家禽免疫器官内细胞存在着少量自然凋亡现象，研究表明细胞凋亡时存在着典型的形态学变化，凋亡基因参与了细胞凋亡的调控。
李玉谷等用透射电镜观察了常规饲养鸭、鹅胸腺细胞的自然凋亡。正常胸腺组织内有少量凋亡的胸腺细胞，主要见于胸腺皮质。鹅胸腺细胞发生凋亡时。胸腺细胞胞体、胞质和胞核均发生形态学变化。其中细胞核的变化最为明显，表现为染色质凝集、边集，呈现新月形、C字形、花瓣状、圆环状或圆斑状。部分凋亡胸腺细胞可见线粒体轻度增生现象。至凋亡后期，胸腺细胞由其膜性结构分隔、包裹形成凋亡小体；最后，凋亡小体或凋亡细胞被巨噬细胞吞噬、清除。李奎等研究了固始鸡中枢免疫器官细胞和自然凋亡细胞的超微结构，认为固始鸡与鸭、鹅免疫器官细胞自然凋亡的形态学变化上有相似之处。
张书霞等用多种方法研究了成年鸡和鸡胚免疫器官细胞凋亡及细胞凋亡的基因表达。用一步法从17日龄来克亨SPF鸡胚和90日龄成年鸡的法氏囊、脾脏和胸腺组织中提取总RNA(TRNA)，用鸡B细胞淋巴瘤白血病-2基因(bcl-2)cDNA探针进行Northernblot。发现bcl-2在成年和胚胎期鸡不同免疫器官中表达量不同，成年鸡bcl-2基因的表达量多少依次为胸腺、脾脏、法氏囊，而胚胎期鸡则是胸腺、法氏囊、脾脏。同时用流式细胞仪测定这些器官的细胞凋亡情况，胚胎期鸡法氏囊、脾脏和胸腺的细胞凋亡率分别是0.40%、0.68%和0.38%；成年鸡则是6.98%、1.17%和0.61%。结果表明，鸡bcl-2基因通过阻抑细胞凋亡直接调控正常免疫器官的发育，在淋巴细胞发育过程中，bcl-2是免疫细胞亚型选择的重要调节物。
张书霞等研究了鸡bcl-2表达质粒的构建及其对转染细胞凋亡的影响，构建了巨细胞病毒(CMV)驱动及牛生长激素polyA加尾信号修饰的bcl-2cDNA真核表达质粒pCDCB1。随后，采用脂质体转染方法，将扩增并纯化的pCDCB1转染至培养的SPF鸡胚次代单层成纤维细胞(CEF)内，96h后收集全部贴壁及上清脱落细胞，用Dot blot检测bcl-2的表达，用流式细胞术测定其细胞凋亡率。发现pCDCB1转染后96h，bcl-2在CEF中呈高度表达；CEF平均凋亡率1.14%，明显低于转染空白载体质粒的对照组7.64%的凋亡率，DNA合成期(S期)细胞为21.58%，也低于对照组。结果证实鸡bcl-2的表达可显著抑制体外培养CEF凋亡进程，其效应与细胞DNA合成和增殖无关。用流式细胞法测定了30日龄AA肉鸡的胸腺、法氏囊和脾脏细胞中半胱天冬酶-3(caspase-3)、Bcl-2蛋白的表达及细胞周期和细胞凋亡率。结果胸腺、脾脏、法氏囊中G0/G1期细胞比例分别是96.44%、68.09%和92.97%；G2/M期细胞比例是0.80%、1.04%和2.36%；S期细胞为2.77%、30.52%和4.67%，表明细胞增殖活性的增殖指数(PI)为3.56、31.92和7.03。胸腺、法氏囊、脾脏细胞凋亡率分别是3.99%、0.32%和0.22%；caspase-3表达的阳性细胞率14.24%、8.60%和5.49%，与细胞凋亡率呈方向一致的变化；Bcl-2蛋白表达阳性细胞率依次为20.59%、30.24%和31.32%，与细胞凋亡率呈反向变化。以上结果表明，鸡免疫器官细胞凋亡是依赖caspase-3介导的细胞凋亡，caspase-3和bcl-2是鸡免疫器官发育的重要调节物。
2 家禽免疫器官内细胞诱导凋亡及其基因调控
有研究认为，热应激可以导致免疫器官变化和免疫抑制。肉仔鸡在32℃以上的条件下饲养，会因为热应激影响生产性能，机体免疫力下降，发病率和死亡率增加，热应激能够诱导动物胸腺细胞凋亡。王晓霞等研究了热应激与生产性能、组织过氧化损伤及抗氧化问题。宁章勇等研究了热应激肉仔鸡胸腺、法氏囊超微组织学观察和细胞凋亡检测，认为热应激可以造成肉仔鸡的中枢免疫器官胸腺和法氏囊部分淋巴细胞发生凋亡，对免疫器官的影响是逐渐加重的过程，呈现部分淋巴细胞从凋亡到坏死的病理学变化过程。
张书霞等研究了热应激对30日龄AA肉鸡胸腺细胞凋亡的影响及其调节机理。把30日龄AA肉鸡随机分成3组，分别进行0,5、10h的41℃高温应激处理。然后用流式细胞仪检测胸腺细胞DNA含量、细胞凋亡率以及细胞caspase-3、bcl-2的表达。发现热应激处理0、5、10h时，①DNA合成期(S期)细胞比例分别是2.77%、3.28%和2.31%；②胸腺细胞凋亡率分别为3.99%、11.15%和3.31%；③caspase-3表达阳性率分别为14.24%、27.01%和10.84%，bcl-2表达阳性细胞率分别为20.59%、15.13%和27.92%；④应激5h与0 h和10h的细胞凋亡率、caspase-3和bcl-2的阳性细胞表达率均有显著差异(P<0.05)；⑤应激处理鸡的胸腺细胞凋亡率、caspase-3表达阳性细胞率从0h到5h逐渐升高，以后又逐渐下降。在高温应激过程中，胸腺细胞凋亡率与caspase-3表达阳性率呈平行的变化关系，而与bcl-2的阳性细胞表达率呈反向变化关系。这些结果均说明高温应激能明显影响胸腺细胞凋亡，而这种细胞凋亡的变化受caspase-3和bcl-2表达的调节。
有人用病原微生物刺激家禽诱导了免疫器官的细胞凋亡。鸡新城疫病毒标准强毒人工感染鸡后可以诱导胸腺和法氏囊淋巴细胞凋亡，淋巴细胞凋亡数量显著增加(P<0.01)，同时引起淋巴细胞坏死，造成淋巴细胞数量减少，导致免疫抑制。
用人工感染马立克病病毒诱导的方法，通过光镜、电镜和免疫组织化学等方法观察了海兰鸡肝脏、肾脏、心脏、腺胃、卵巢、羽髓等实质器官细胞凋亡及凋亡的机制。光镜观察，可见肝细胞、肾小管上皮细胞、腺胃上皮细胞、心肌纤维、脾脏内淋巴细胞、卵巢内的颗粒细胞、羽髓细胞的细胞核裂解成大小不等的、致密浓染的球形团快。电镜观察，可见这些细胞的细胞核染色质经历了凝集、边集、裂解，最后形成许多凋亡小体等不同阶段。免疫组织化学研究结果显示，上述细胞均有明显的FasL表达，FasL的表达表明细胞凋亡信号增强，细胞凋亡发生。
也有人用传染性法氏囊病病毒人工感染SPF鸡(IBDV)的方法，用电镜观察了接种后2 h和4h的胸腺细胞，发现胸腺细胞胞浆浓集、染色质周边化形成新月形，表现出凋亡细胞的特征。刘玉锋等用鸡传染性法氏囊病病毒SNJ93株、BC6/85株、B87株感染36日龄SPF鸡后观察免疫器官淋巴细胞中bcl-2和Bax蛋白的分布定位和动态变化。结果，B87株接种组的法氏囊、脾脏、胸腺淋巴细胞中这两种蛋白在各检测时间均为阴性反应；SNJ93株、BC6/85株攻毒组胸腺淋巴细胞这两种蛋白呈阴性反应，SNJ93株攻毒组法氏囊和脾脏淋巴细胞在48h即开始出现bcl-2和Bax阳性反应，法氏囊淋巴细胞内这两种蛋白在感染后72、96、120h呈现明显的阳性反应，以后开始降低，脾脏淋巴细胞内这两种蛋白在感染后72 h、96h出现强阳性反应；BC6/85株攻毒组法氏囊淋巴细胞中只在96 h、120 h出现阳性反应，脾脏淋巴细胞中只在96 h呈现阳性反应。
化学性物质和微量元素过度应用也可以诱导家禽免疫器官细胞凋亡。陈志胜等用Tunel法研究了三肽囊素对环磷酰胺诱导的鸡免疫抑制模型中免疫器官细胞凋亡的影响。将180只1日龄粤黄鸡随机分成环磷酰胺组、正常对照组、三肽囊素组及三肽囊素＋环磷酰胺组，利用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dTUP缺口末端标记法(Tunel)，对不同组鸡的免疫器官细胞凋亡进行计数。结果发现，环磷酰胺组细胞凋亡数比对照组明显增多(P<0.05)，而三肽囊素加环磷酰胺组细胞凋亡数显著少于环磷酰胺组(P<0.05)；三肽囊素组的细胞凋亡数比环磷酰胺组少，且差异显著(P<0.05)。由此可知，三肽囊素对环磷酰胺所诱导的细胞凋亡具有抑制作用。
霍霞等用放线菌酮处理第15天胚龄鸡胚，建立鸡胚脾脏细胞凋亡模型，用透射电镜进行观察，着重观察鸡胚脾脏凋亡细胞核及其环孔板的形态学变化。结果表明，凋亡细胞为各类幼稚血细胞，以幼稚淋巴细胞为主，巨噬细胞未见凋亡。凋亡细胞核在裂解分离为核碎块的过程中出现环孔板，凋亡细胞核完全裂解分离后，环孔板消失。由此可见，环孔板参与凋亡细胞核的分割以及核碎片的包裹，提示凋亡细胞核裂解成为核碎块形成凋亡小体的过程是一个主动的过程。
崔恒敏等用电子显微镜和流式细胞仪研究了铜中毒对雏鸭免疫器官细胞凋亡的影响。选用1日龄天府肉鸭健雏210只，随机分为3组，分别喂以对照日粮(Cu12.16 mg/kg)、中毒Ⅰ日粮(Cu 850 mg/kg)、中毒Ⅱ日粮(Cu 1 050mg/kg)7周，用电子显微镜和流式细胞仪观察铜中毒对雏鸭免疫器官细胞凋亡影响。电镜观察结果显示，铜中毒Ⅰ组和铜中毒Ⅱ组免疫器官淋巴细胞发生凋亡的频率明显高于对照组，发生凋亡的淋巴细胞表现为染色质凝聚、边集、细胞核呈新月形、C字形、花瓣状、圆环状或圆斑状，并出现凋亡小体。流式细胞仪测定，2个中毒组免疫器官淋巴细胞凋亡百分率也明显高于对照组。上述结果表明了铜中毒可以诱导淋巴细胞凋亡。
3 固始鸡免疫器官内细胞凋亡及其基因调控
从2004年开始，李奎等开展了固始鸡免疫器官生长发育研究。应用电子显微镜技术，对固始鸡和固始鸡胚胎免疫器官细胞和自然凋亡细胞超微结构的研究结果表明：①胸腺、法氏囊和脾脏内淋巴细胞存在着少量自然凋亡现象；自然凋亡的淋巴细胞形态、位置和过程与诱导凋亡的淋巴细胞相似；凋亡细胞主要变化是细胞核染色质凝集为各种形态，线粒体明显增生，凋亡小体形成；②巨噬细胞不但迅速清除凋亡小体，而且细胞凋亡信号一启动，凋亡细胞即可被巨噬细胞识别，并迅速吞噬。③鉴于对固始鸡免疫器官内淋巴细胞自然凋亡的观察及以上结论，相关文献中叙述用各种因素诱导的家禽免疫器官凋亡细胞，单纯从凋亡细胞超微结构方面，不能确定其是诱导凋亡还是自然凋亡。
李奎等应用免疫组织化学技术对主要凋亡基因在固始鸡免疫器官内动态表达的研究结果表明：①Bax在不同发育阶段固始鸡免疫器官内均有表达，但表达量不同；Bax表达于固始鸡免疫器官内淋巴细胞细胞膜、细胞浆和细胞核；Bax表达阳性细胞在固始鸡不同免疫器官内分布位置不同，呈散在或簇团状分布：脾脏内不同部位均有分布，主要在动脉周围淋巴鞘、红髓、淋巴小结边缘、边缘区，很少出现在淋巴小结内；胸腺内主要分布于胸腺小叶的皮质与髓质交界处，其次是胸腺小叶髓质，极少出现于皮质；法氏囊内阳性细胞主要分布于黏膜靠近上皮细胞的固有膜层内、淋巴小结与淋巴小结之间区域，在淋巴小结边缘的少量淋巴细胞也有Bax表达，淋巴小结内极少有阳性细胞。②p53在不同发育阶段固始鸡脾脏内均无表达。在胸腺和法氏囊内有少量表达。③Bcl-2蛋白表达于固始鸡免疫器官内淋巴细胞细胞膜、细胞浆和细胞核。Bcl-2阳性细胞在不同免疫器官有不同的分布位置。固始鸡脾脏内有少量Bcl-2表达阳性细胞；不同发育阶段固始鸡胸腺内均有少量Bcl-2表达的阳性细胞。④Fas蛋白表达于固始鸡免疫器官内淋巴细胞细胞膜和细胞浆，不表达于细胞核。Fas在固始鸡不同免疫器官内的表达部位不同；不同发育阶段固始鸡免疫器官内均有Fas表达，但表达量有所差异。⑤FasL蛋白表达于固始鸡不同免疫器官淋巴细胞细胞膜和细胞浆，不表达于细胞核，与Fas相似。FasL在固始鸡不同免疫器官内的表达位置也与Fas相似，而表达量比Fas低。以上结果表明了细胞凋亡基因Bax、p53、Bcl-2、Fas和FasL参与了固始鸡免疫器官内淋巴细胞凋亡的调控，对免疫器官的稳定起到重要作用。
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