乳房链球菌GAPC基因的克隆及原核表达

摘　要：为了重组表达乳房链球菌表面脱氢酶GAPC基因，为免疫学研究提供目标蛋白，用PCR方法从石河子分离株的基因组DNA中扩增出GAPC基因，用T/A克隆法将其插入PBST载体，并构建原核表达载体pET-32a(＋)-GAPC。用BL21(DE3)/pET系统表达Trix-GAPC融合蛋白，SDS-PAGE和Westernblot分析鉴定表达产物。结果表明，PCR扩增产物经测序，证实与GenBank中乳房链球菌(AF421900.1)GAPC的基因序列同源性为99%。SDS-PAGE显示，经IPTG诱导后BL21(DE3)/pET-32a(＋)-GAP总蛋白中出现一条分子质量为55ku的新蛋白带。Westernblot分析显示，GAPC蛋白可与乳房链球菌多克隆抗血清发生特异性反应。该研究已成功表达了GAPC，为GAPC在细菌致病中作用的研究以及相关疫苗的制备奠定了基础。

关键词：乳房链球菌；表面脱氢酶GAPC；原核表达

乳房链球菌(Streptococcusuberis)是引起奶牛乳房炎的主要致病菌之一。利用疫苗来控制奶牛乳房炎是防控本病的发展趋势。3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehydes-3-phosphatedehydrogenase，GAPc)是糖酵解过程中的关键酶。1993年，Waine GJ等报道重组日本血吸虫GAPc作为侯选疫苗的研究。最近，在布鲁菌、乳房链球菌中也发现，GAPc蛋白具有良好的抗原性和免疫原性，可以作为这些病原微生物良好的疫苗候选抗原。本研究克隆并构建了乳房链球菌GAPc的原核表达体系，表达和纯化了GAPc，为乳房链球菌新型疫苗的制备奠定了基础。

1　材料与方法

1.1　材料

S.uberis菌株SHZ11从新疆石河子某团场奶牛场分离。大肠埃希菌DH5α、BL21(DE3)及表达载体pET-32a(＋)为本室保存。pBS-T载体、T4DNA连接酶、TaqDNA聚合酶、DNAMARK、DNA胶回收试剂盒、羊抗鼠HRP-IgG及底物DAB均购自天根生化(北京)科技有限公司；限制性内切酶BamHⅠ、SacⅠ购自Progema公司；硝酸纤维素膜及蛋白质MARK购自上海生工生物工程技术服务有限公司。昆明系小鼠由石河子大学实验动物中心提供。

1.2　方法

1.2.1　乳房链球菌基因组DNA的提取　按照徐淑菲提取猪链球菌2型基因组的方法，由乳房链球菌菌体中提取总DNA。

1.2.2　引物的设计与合成　参照GenBank发表的乳房链球菌GAPC基因(AF421900.1)设计引物。上游引物P1：5′-CCGGATCC ATGGTAGTTAAAGTTGGTATTAACGG-3 ′，P2：5′-GCGAGCTCTTATTTAGCGATTTTTGCAAAGTACTC-3′，上游引物中引入BamHⅠ酶切位点，下游引物中引入SacⅠ酶切位点。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2.3　表达质粒的构建

1.2.3.1　PCR扩增　以提取的基因组DNA作为模板，通过PCR扩增目的片段GAPC，反应条件为预变性95 ℃ 5min；95 ℃1 min,55 ℃ 30 s,68 ℃ 1 min，30个循环；最后72℃延伸10 min。扩增产物在10g/L琼脂糖凝胶中电泳。根据分子质量Marker标示，从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，按DNA快速纯化胶回收试剂盒操作步骤，回收扩增产物。

1.2.3.2　目的基因的克隆和序列测定　回收的DNA与pBS-T载体连接，按照说明操作。连接产物的转化按文献操作。用蓝白斑筛选挑选白色菌落，抽提质粒进行PCR及酶切鉴定。将鉴定正确的基因克隆分别经BamHⅠ和SacⅠ双酶切，琼脂糖凝胶电泳后回收目的片段，连接到经同样双酶切并纯化的载体质粒pET-32a(＋)上，将连接产物转化至宿主菌DH5α，氨苄青霉素抗性固体培养基筛选阳性重组子，提取质粒，用PCR和酶切鉴定。将筛选出含有目的片段的阳性克隆，由上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。

1.2.3.3　GAPC基因表达菌的培养和诱导　表达质粒pET-32a(＋)-GAPC转化BL21(DE3)，在含有氨苄青霉素(100ug/mL)的LB培养基中，于37℃过夜振荡培养，然后以1/100的比例接种于相同的培养基，于37℃振荡培养至D(600 nm)为0.7时，加入IPTG至终浓度为1.0mmol/L,37 ℃诱导4 h后，离心收集菌体。

1.2.3.4　SDS-PAGE分析　取1.5 mL诱导表达后的菌液，离心收集菌体加入80 μL的SDS上样缓冲液，100℃煮沸10min，于120 g/L的SDS-PAGE进行电泳，同时用未加IPTG诱导的菌体作对照。电泳结束后取出凝胶后进行染色、脱色，观察效果。

1.2.3.5　免疫印迹　参照文献的方法进行半干式转印。利用初纯的菌体制备的多抗为一抗，HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗，DAB显色试剂盒显色。

2　结果

2.1　PCR产物的鉴定

扩增产物在10 g/L琼脂糖凝胶中电泳，根据DNA Marker标示，在约1 000bp处可见到一条带，大小与预计相符，见图1。

1～2.PCR产物；3.阴性对照；M.DNA标准

1-2.Products of PCR；3.Negative control；M.DNA Marker

图1　GAPC基因片段的PCR产物

Fig.1　PCR products of GAPC gene

2.2　重组表达质粒的鉴定

将目的片段亚克隆于pBS-T载体，经酶切鉴定阳性重组质粒，见图2。将重组表达质粒pET-32a(＋)-GAPC双酶切后，经8g/L琼脂糖凝胶电泳分析，在约1 000bp处可见DNA条带，见图3，表明质粒DNA构建成功。

1.质粒对照；2.阳性重组质粒的双酶切(BamHⅠ＋SacⅠ)；M.DNA标准

1.Plasmid control；2.Restriction endonuclease analysis of thepositive recombinant by plasmidBamHⅠ＋SacⅠ；M.DNA Marker

图2　阳性重组质粒的酶切鉴定

Fig.2　Restriction map of positive recombinant plasmid

1.阳性重组质粒的双酶切(BamHⅠ＋SacⅠ)；2.质粒对照；M.DNA标准

1.Restriction endonuclease analysis of positive recombinant plasmidbyBamHⅠ＋SacⅠ；2.Plasmid control；M.DNA Marker

图3　pET-32a(＋)-GAPC重组质粒的酶切鉴定

Fig.3　Restriction map of pET-32a(＋)-GAPC recombinant

2.3　测序结果

将酶切鉴定阳性克隆的测序结果与GenBank中的序列比对，发现与公布的GenBank中乳房链球菌GAPC基因(AF421900.1)序列同源性为99%，说明GAPC基因的保守性。

2.4　重组质粒在BL21(DE3)中表达产物的SDS-PAGE鉴定

SDS-PAGE电泳分析表明，在IPTG的诱导下，转化的含有重组质粒的BL21(DE3)表达出了55 ku的融合蛋白(图4)。

1.BL21(DE3)空菌对照；2.pET-32a(＋)空载体对照(IPTG诱导4 h)；3.IPTG诱导4h后的表达蛋白；4.诱导之前的表达蛋白；M.蛋白分子质量标准

图4　诱导表达产物的SDS-PAGE电泳分析

Fig.4　Analysis of expressed proteins by SDS-PAGE

2.5　Western blot检测

Westernblot结果显示，原核表达的GAPC融合蛋白同菌体抗血清发生了特异性反应，表明扩增的片段含有GAPC的抗原决定簇(图5)。

M.蛋白分子质量标准；1.乳房链球菌抗血清免疫转印蛋白；2.IPTG诱导4 h后的表达蛋白；3.诱导之前的表达蛋白

图5　表达产物的Western blot检测

Fig.5　Western blot dection of the expressed products

3　讨论

奶牛乳房炎是影响奶业发展的一个主要的因素。加强饲养管理和环境卫生是控制奶牛乳房炎的基本措施，而利用疫苗来控制奶牛乳房炎是防控本病的发展趋势。利用病原体的某些生理代谢酶作为疫苗的重要靶分子，已引起了极大关注。有关寄生原虫，如锥形虫和利什曼原虫的3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)，已在基因水平上进行深入研究，GAPDH参与了细胞的基本代谢过程，它被认为是看家(Housekeeping)基因。DaubenbergerCA等比较了疟原虫二磷酸果糖酶和GAPDH蛋白的空间定位，发现GAPC蛋白定位于疟原虫细胞膜表面，属于膜表面GAPDH分子家族的成员。因此，研究者认为GAPDH可以作为疟原虫分子疫苗和药物的侯选靶位。国内学者闫玉涛克隆了日本血吸虫的GAPDH，并制成核酸疫苗进行了小鼠试验，结果能诱导Thl类型细胞免疫应答。吴德等克隆了华支睾吸虫GAPDH基因，张咏莉等对华支睾吸虫GAPDH重组蛋白进行免疫原性研究，在免疫过程中华支睾吸虫GAPDH抗体滴度呈连续上升趋势。免疫小鼠血清具有抗华支睾吸虫GAPDH特异性抗体。制备的重组蛋白华支睾吸虫GAPDH具有较好免疫原性。最近，布鲁菌，曼氏血吸虫，乳房链球菌，金黄色葡萄球菌的GAPDH蛋白的另一个重要特性被发现，GAPDH蛋白有良好的抗原性和免疫原性，可以作为这些病原微生物良好的疫苗候选抗原。在A族链球菌上发现一种表面脱氢酶(surfacedehydrogenase，SDH)，它不但具有GAPDH活性，而且具有结合多种蛋白质的能力，被认为是一种重要的表面抗原。随后在乳房链球菌中也克隆到这种具有GAPDH活性的表面脱氢酶，称之为GAPC，被认为是未来乳房链球菌疫苗的良好靶位点。

本文选择石河子分离株菌株的基因组DNA作为GAPC构建的模板，成功地从中扩增出GAPC基因，经测序检测，与GenBank公布的乳房链球菌(AF421900.1)的GAPC的基因序列有99%的同源性，说明其保守性很强。在试验中观察到，IPTG终浓度为1.0mmol/L,37 ℃诱导4 h可有较高的表达量。Westernblot分析结果显示，原核表达得到的融合蛋白具有良好的抗原性，这为进一步开展基因工程亚单位疫苗的研制奠定了基础。