摘 要：从国内发病猪场采集的猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病料中，分离到8株猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)。病毒分离培养表明，JS1～JS5第1代即可适应Marc-145细胞。GD1～GD3经Marc-145细胞3次～4次传代后出现明显的细胞病变。间接免疫荧光试验表明，8个分离毒株与抗PRRSV抗体均可出现特异性的胞浆荧光。它们对氯仿、甲醛、酸和碱均敏感。5-溴-2′-脱氧尿核苷对其无抑制作用。参照GenBank中已发表的PRRSV的序列设计了两对特异性引物，分别对所分离毒株进行部分nsp2基因和结构基因的扩增。发现JS1～JS5nsp2基因发生了部分缺失。选择JS1、JS5、GD3进行nsp2基因和结构基因的扩增和测序。序列分析结果表明，JS1、JS5和2006年以后国内分离到的高致病性PRRSV高度同源。GD3的Nsp2基因虽然没有发生第534位～第562位氨基酸的缺失，但与2006年以后分离的毒株一样，发生了第482位氨基酸的缺失。通过对3个分离毒株与其他国内分离毒株的结构基因序列进行系统进化分析发现，我国的PRRSV流行毒株可大致划分为两个亚型，JS1、JS5、GD3、CH-1a、JXA1、HUN4、SHH等属于一个亚型，BJ-4、CC-1属于另一个亚型。亚型间核苷酸序列同源性为91.2%～91.8%。
关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒；流行毒株；分离；鉴定；结构基因
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratorysyndrome，PRRS)是猪的一种重要的病毒性传染病，主要以母猪发热、厌食、流产、死产、木乃伊胎、弱仔等繁殖障碍以及仔猪的呼吸道症状和高死亡率为特征。1987年，美国北卡罗来纳州、明尼苏达州及衣阿华州等地的猪群中首次暴发了这种病，其特点是发病猪群兼有繁殖障碍和呼吸道症状，由于对该病前所未闻且病原不明，所以被称为“猪神秘病”(Mysteryswine disease，MSD)。1990年冬，欧洲开始流行MSD，首先在德国的Munster地区附近出现，并迅速蔓延到其他地区。1990年底，荷兰科学家WensvoortG等首次在感染猪体内分离到病毒，并将其命名为Lelystadvirus(LV)。随后德国和美国学者也相继从本国猪体内分离到相似的病毒。1992年5月，在美国的明尼苏达州召开了首届SIRS/PRRS国际研讨会，将流行于各国的此类疾病统一为PRRS，它比较全面而科学地反应了该病的主要特征，因而被各国普遍接受。目前PRRS作为世界性流行病广泛传播于许多国家，已经成为全球兽医界关注的热点问题。
猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndromevirus，PRRSV)是有囊膜的单股正链RNA病毒，属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属，基因组全长约为15kb，含有9个开放阅读框(open reading frames，ORFs)。其中ORF1a和ORF1b编码病毒的非结构蛋白，ORF2～ORF7编码病毒的结构蛋白。按其遗传差异和抗原性差异，可分为欧洲型(原型毒株为LV)与美洲型(原型毒株为VR-2332)。欧、美型毒株的序列比较显示，ORF1序列的相似性约为60%。其中ORF1a的变异最为明显，是在PRRSV的9个ORF中变异最大的一个。通过序列比较推测PRRSV的ORF1编码的多聚蛋白可水解为13个非结构蛋白，即Nsp1α，Nsp1β及Nsp2-12。Nsp2为各毒株间差异较大的的一个编码区。根据童光志等的分析，在2006年流行于中国的以Nsp2基因部分缺失为特征的PRRSV对猪是高致病性的。结构蛋白分别由ORF2～ORF7编码，ORF2～5分别编码病毒的糖蛋白GP2～GP5，ORF6编码膜蛋白(M蛋白)，ORF7编码保守的核衣壳蛋白(N蛋白)。据高志强等分析，美洲型毒株GP2a蛋白的推导氨基酸序列的相似性在91%～99%，GP3为86%～98%，GP4为92%～99%。GP3是PRRSV各毒株间保守性最差的蛋白之一，在欧、美型毒株间推导氨基酸的相似率为54%～60%。欧、美型毒株间M蛋白的推导氨基酸序列最为保守，同源率在78%～81%。而同型毒株M蛋白推导氨基酸的相似率大于96%。N蛋白基因也是非常保守的，北美毒株间N蛋白推导氨基酸序列的相似率在96%～100%。
由于不同PRRSV分离株核苷酸序列存在广泛而明显的变异，给PRRS的准确检测和有效控制带来困难。特别是自2006年发生的以高热、高发病率和高死亡率为特征的传染病以后，人们对PRRS投入了更多的关注。本研究对2005年和2006年分离的国内流行毒株进行Nsp2基因和结构基因的进化关系分析，希望能为揭示我国PRRS流行情况、PRRSV变异规律提供有益的数据补充。
1 材料与方法
1.1 细胞、病毒与菌种
Marc-145细胞，分离毒株疑似病料，菌种JM109。
1.2 酶及化学试剂
RT-PCR试剂盒、各种限制性内切酶、PMD-18T载体均为宝生物工程(大连)有限公司产品；Super Script?ⅢReverseTranscriptase购自invitrogen公司；Anti-pig lgG(wholemolecule)-FITC；猪抗PRRSV阳性血清为本实验室保存。
1.3 病毒的分离与增殖
Marc-145细胞生长至单层后，弃去营养液，将分离毒株疑似病料研磨，经滤器过滤后接种Marc-145细胞，于37 ℃吸附1h，然后加入含30 mL/L犊牛血清、100单位/mL双抗的DMEM的细胞营养液，在37 ℃培养3 d～4d，观察是否出现细胞病变。如果产生病变，将细胞反复冻融3次，将收获的病毒培养物－20 ℃保存备用。
1.4 间接免疫荧光实验
将接毒培养24 h～48h后的Marc-145细胞弃去营养液后用胰酶消化，将消化下来的细胞离心，收集细胞沉淀。把所收集的细胞沉淀均匀涂布于载玻片上，丙酮4℃固定3min～5 min。用荧光PBS洗涤3次后把1∶20稀释好的猪抗PRRSV阳性血清均匀覆盖住样品。置于37 ℃温育1h，用荧光PBS洗涤3次。加1∶80稀释好的FITC标记的羊抗猪IgG二抗，37 ℃温育1h，用荧光PBS洗涤3次。最后加缓冲甘油(加入少量，然后吸出，尽量吸干净)。于荧光显微镜下观察。
1.5 病毒理化性质的鉴定
8个分离毒株经不同方法处理后，接种于Marc-145细胞单层的96孔细胞培养板，培养120h，以CPE为判定标准，按Reed-Muench法计算TCID50。通过对病毒核酸类型的鉴定，病毒的耐酸性以及氯仿敏感实验，甲醛敏感实验进一步对病毒进行确定。
1.6 病毒总RNA的提取及RT-PCR
取病毒培养物，按Trizol，细胞悬液为2∶1(600 μL∶300μL)加入Trizol试剂，上下振荡数次，静置5min，加入等体积(600 μL)的氯仿，静置5 min，12 000r/min离心5 min，吸取上清，加入900 μL的异丙醇，12 000 r/min离心15min沉淀RNA，倒掉异丙醇，加入750 mL/L的乙醇1 mL，7 500 r/min离心5 min，轻轻吸净乙醇后晾干备用。
参照GenBank中已发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒的基因序列，用Oligo软件设计一对扩增部分nsp2基因的引物和扩增结构基因的引物。引物序列见表1。
表1 试验所使用的引物序列
Table 1 The primers used in the study
片段 Fragment | 引物 Primer | 序列 Sequence | 大小 Length |
ORF2～ORF7 | upper | 5′-ATTATAAGCCACTGCCACCAG -3′ | 360 bp |
ORF2～ORF7 | lower | 5′- CCCCTTCACCACACATTCTTCC -3′ | |
Nsp2 | upper | 5′-ATTTTCCGACACCATCCGAGCCGAT -3′ | 3 360 bp |
Nsp2 | lower | 5′-AGGTATGGATACCCGAGTCGATGATGGCTT -3′ |
1.7 PCR产物的回收纯化及目的片段的克隆与序列测定
按宝生物工程(大连)有限公司的DNA纯化试剂盒(TaKaRa Agarose Gel DNA Purification KitVer.2.0)说明书回收PCR产物。将经过回收的PCR产物与PMD-18TVector连接，连接产物转化JM109感受态细胞，涂布氨苄青霉素培养皿，37℃培养过夜。挑取单个菌落扩大培养后提取质粒进行酶切鉴定，对阳性质粒进行序列测定。
1.8 序列比较与分析
利用Gene Runner，DNAStar等生物信息学软件对获得的基因序列进行分析，并将获得的基因序列与国内外分离的毒株进行比较(表2)，尤其是2006年新收录的毒株进行比较分析，构建系统进化树。
表2 同源序列比较所采用的参考毒株序列来源
Table 2 Details of strains in the alignment
毒株 Viral strains | 登录号 GenBank accession No. | 来源国家 Country | 毒株 Viral strains | 登录号 Genbank accession No. |
VR-2332 | AF030244 | 美国 USA | JXA1 | EF112445 |
CH-1a | AF059352 | 中国 China | HUN4 | EF635006 |
16244B | AF046869 | 美国 USA | GD | EU109503 |
PA8 | AF176348 | 加拿大 Canada | LN | EU109502 |
MLVRespPRRS/Repro | AF159149 | 美国 USA | HEB1 | EF112447 |
RespPRRS MLV | AF066183 | 美国 USA | HUB1 | EF075945 |
SP | AF184212 | 新加坡 Singapore | HUB2 | EF112446 |
CC-1 | EF153486 | 中国 China | BJ-4 | AF331831 |
2 结果
2.1 病毒的分离
将处理好的病料接种于生长良好的Marc-145细胞，3 d～4d左右，可见细胞发生聚丛成堆现象，并且越来越严重，甚至出现细胞脱落现象。JS1～JS5第1代即可产生明显的细胞病变，GD1～GD3盲传3代以后可产生稳定的细胞病变(cytopathiceffect，CPE)(图1)。
2.2 间接免疫荧光试验
间接免疫荧光(indirect immunofluorescentassay，IFA)试验表明，8个分离毒株与抗PRRSV抗体均可出现特异性的胞浆荧光(图2)。A.接种分离毒株后产生的CPE；B.正常的Marc-145细胞
A.接种分离病毒细胞的IFA；B.正常Marc-145细胞的IFA
A.CPE of isolates in Marc-145 cells；B.Normal Marc-145 cells
图1 分离毒株接种Marc-145细胞后产生的变化
Fig.1 CPE in Macr-145 cellsinfected with the isolates
A.IFA results of Macr-145 cells infected with isolates；
B.IFA results of normal Macr-145 cells
图2 间接免疫荧光试验鉴定分离毒株
Fig.2 Detection of PRRSV infected Marc-145 cells by indirectimmunofluorescent assay(IFA)
2.3 病毒理化性质的鉴定
8个分离毒株经不同方法处理后，接种于Marc-145细胞单层的96孔培养板培养120h，以CPE为判定标准，按Reed-Muench法计算TCID50。结果表明这8个分离毒株对氯仿敏感，不耐酸(pH 3.0)(表3)。病毒核酸复制以RNA形式出现。
表3 不同处理方法对分离毒株稳定性的影响
Table 3 Infectivity of strainsfol lowing treatment with rariousmethods
处理方法 Treatment metheds | TCID50/log10 | ||||||
JS1 | JS2 | JS3 | JS4 | JS5 | GD1 | GD2 | |
BUDR(60 μg/mL) | 5 | 4.8 | 5.2 | 5 | 5.4 | 3.2 | 3.9 |
氯仿处理(5%,4 ℃ 24 h)Chloroform | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
甲醛处理(0.2% 2 h)Formalin | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
pH 3.0,4 ℃，18 h | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
5.0 | 4.3 | 4.1 | 4.5 | 4.2 | 4.2 | 2.7 | 2.4 |
6.8 | 4.5 | 4.4 | 4.7 | 4.6 | 4.4 | 2.9 | 2.9 |
7.1 | 4.7 | 4.6 | 5 | 4.7 | 4.8 | 3.0 | 3.2 |
7.4 | 5 | 4.8 | 5.2 | 5 | 5.4 | 3.2 | 3.9 |
8.0 | 2.4 | 1.6 | 1.9 | 2.1 | 1.8 | 0.4 | 0.6 |
不处理 Untreated | 5 | 4.8 | 5.2 | 5 | 5.4 | 3.2 | 3.9 |
2.4 特异性扩增产物的鉴定
应用设计的特异性引物对分离毒株进行Nsp2的扩增，发现JS1～JS5括增片段长度约为450bp左右，Nsp2发生部分缺失，而GD1～GD3的括增长度约为540bp左右，Nsp2没有发生类似于2006年分离的高致病性PRRSV特异性的缺失(图3)。
1.DNA Marker DL 2000；2.JS1；3.JS2；4.JS3；5.JS4；6.JS5；7.GD1；8.GD2；9.GD3.10.H2O
图3 8个毒株nsp2基因的扩增结果
Fig.3 The amplication results of eight strains’nsp2 gene
结构基因括增长度与预期相符，括增长度约为3 300 bp左右(图4)。
1.DNA Marker 5 000 bp；2.JS1；3.JS5；4.GD3
图4 3个毒株结构蛋白基因的扩增结果
Fig.4 The amplication results ofthree strains’structural gene
2.5 重组质粒的酶切鉴定
对结构基因重组质粒进行EcoRⅠ和SalⅠ双酶切，产生了预期大小相符的片段(图5)。
1.DNA Marker 5 000 bp；2.JS1；3.JS5；4.GD3；5.DNA Marker DL 2 000
图5 重组质粒的EcoRⅠ和SalⅠ双酶切结果
Fig.5 Digestion of the recombinant plasmid byEcoRⅠandSalⅠ
2.6 序列测定及分析
2.6.1 3个分离株Nsp2的比较 通过对3个分离株Nsp2的比较，发现JS1和JS5在第482位和第534位～第562位氨基酸均发生了缺失。GD3虽然没有发生第534位至第562位氨基酸的缺失，但与2006年以后分离的毒株一样，发生了第482位氨基酸的缺失(图6)。
图6 分离株氨基酸序列
Fig.6 Amino acid sequences of three strains
2.6.2 3个分离株结构基因的比较分析 将3个分离毒株的结构基因核苷酸序列与2006年以后国内新发表的毒株JXA1、HUN4、GD、LN、HEB1、HUB1、HUB2、LN及VR-2332、CH-1a、BJ-4、PA8、RespPRRSMLV等毒株株的相应结构基因核苷酸序列进行同源性比较。
核苷酸序列比较结果显示，不同分离毒株的相似性在91.0%～99.9%之间，2005年分离到的GD3与HUN4的相似性最高，达到97.6%，反而与BJ-4、CC-1的相似性分别为91.5%和91.4%，但与CH-1a的相似性达到了96%。JS1和JS5的HUN4相似性也达到最高的相似性，为99.7%(表4)。
表4 JS1、JS5、GD3及国内外发表的PRRSV核苷酸同源性比较
Table 4 Homolgical comparison of nucleotide sequence of JS1，JS5，GD3and other PRRSV strains
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | |
1 | * | 93.6 | 99.5 | 98.6 | 99.3 | 99.7 | 99.7 | 93.4 |
2 | * | 93.4 | 92.9 | 93.3 | 93.4 | 93.4 | 92.4 | |
3 | * | 98.5 | 99.2 | 99.9 | 99.8 | 93.1 | ||
4 | * | 98.2 | 98.6 | 98.5 | 92.6 | |||
5 | * | 99.3 | 99.4 | 99.3 | ||||
6 | * | 99.9 | 93.3 | |||||
7 | * | 93.3 | ||||||
8 | * | |||||||
9 | ||||||||
10 | ||||||||
11 | ||||||||
12 | ||||||||
13 | ||||||||
14 | ||||||||
15 | ||||||||
16 | ||||||||
17 | ||||||||
18 | ||||||||
19 |
注(Note)：1.VR-2332；2.CH-1a；3.BJ-4；4.16244B；5.PA8；6.MLVRespPRRS/Repro；7.RespPRRSMLV；8.SP；9.CC-1；10.JXA1；11.HUN4；12.GD；13.LN；14.HEB1；15.HUB1；16.HUB2；17.GD3；18.JS1；19.JS5
2.7 毒力相关氨基酸的推测与变异分析
比较了国内3个分离毒株的这5个氨基酸。结果显示自“高热病”发生后分离毒株的GP3第83位氨基酸位点突变为S，而此前分离的强毒为G，弱毒为E。除此之外，GD3的其他毒力相关位点与高致病性PRRSV保持高度的一致性(表5)。
表5 毒力相关氨基酸的推测与变异分析
Table 5 Comparison of predicted amino acid mutations involved inpathogenesis
毒株 Viral strains | ORF2 | ORF3 | ORF5 | ORF5 | ORF6 |
13 | 151 | ||||
MLVRespPRRS/Repro | F10 | E83 | Q | G | E16 |
RespPRRS MLV | L10 | E83 | Q | R | E16 |
CH-1a | L10 | G83 | R | R | Q16 |
VR2332 | L10 | G83 | R | R | Q16 |
HUN4 | L10 | S83 | R | R | Q16 |
JXA1 | L10 | S83 | R | R | Q16 |
BJ-4 | F10 | E83 | Q | G | E16 |
JS1 | L10 | S83 | R | R | Q16 |
JS5 | L10 | S83 | R | R | Q16 |
GD3 | L10 | G83 | R | R | Q16 |
16244B | L10 | G83 | R | R | Q16 |
2.8 依据结构基因构建的系统进化树
2.8.1 依据ORF3基因构建的系统进化树 见图7。
2.8.2 依据ORF5基因构建的系统进化树 见图8。
2.8.3 依据结构基因构建的系统进化树 见图9。
图7 依据ORF3基因构建的系统进化树
Fig.7 Phylogenetic tree of ORF3 gene of PRRSV
图8 依据ORF5基因构建的系统进化树
Fig.8 Phylogenetic tree of ORF5 gene of PRRSV
图9 依据结构基因构建的系统进化树
Fig.9 Phylogenetic tree of structural gene of PRRSV
3 讨论
PRRSV分离株分为美洲型和欧洲型两种基因型。到目前为止，国内分离的毒株主要为美洲型，但也有国内分离到欧洲型毒株的报道。此次我们从国内发病猪分离到PRRSV分离株均为美洲型。但是由于分离时间的不同，毒株之间存在较大的差异，尤其在Nsp2区域。
自2006年我国发生以高热、高发病率和高病死率为特征的传染病以后，人们对PRRSV投入了更多的关注，据童光志等的研究推测以Nsp2基因部分缺失为特征的PRRSV对猪是高致病性的。此次我们设计的特异性引物可以区分PRRSVNsp2基因是否发生了部分缺失。通过对3个分离毒株进行Nsp2基因的扩增和测序，我们发现2006年分离到的JS1和JS5在Nsp2发生了一个连续29个氨基酸和1个氨基酸位点的缺失，与此前的报道相同，而2005年分离到的GD3毒株仅仅发生了1个氨基酸位点的缺失，并且通过对结构基因序列的比较，我们发现GD3和2006年以后分离到的Nsp2基因发生缺失的毒株的具有较高的相似性，在97.4%以上。因此推断GD3是PRRSV演化变异过程的一个重要阶段。
通过对不同时期分离毒株结构基因的比较发现，自2006年后分离到的Nsp2基因发生部分缺失毒株的GP3第48位氨基酸位点突为M，此前分离的毒株均为T，第83位氨基酸位点突变为S，而此前分离的强毒为G，弱毒为E。GP5第16位氨基酸为F，此前分离毒株均为S。第58位氨基酸突变为Q，此前分离毒株均为N。
Wesley R D等报道，对ORF5的RT-PCR产物进行RFLP分析，可以区分疫苗毒株与野毒株。这是因为疫苗株的第137位氨基酸为Ala，野毒株则为Ser。我们分离的3个毒株第137位氨基酸均为Ser，表明JS1、JS5和GD3均为野毒株。
通过对国内分离毒株的结构基因序列系统进化分析，表明我国目前的PRRSV流行毒株可大致划分为两个亚型，其中BJ-4、CC-1、VR-2332属于一个亚型。而JS1、JS5、GD3、Ch-1a、JXA1、SHH等属于另一个亚型。亚型间核苷酸序列同源性为91.2～91.8%。
本研究通过对近2年PRRSV进行分离鉴定和遗传变异分析，为PRRS流行病学丰富了数据库，同时为研究PRRSV变异规律提供了有益的参考数据。
分享到：