猪传染性胃肠炎病毒重组核蛋白免疫原性的研究

猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）是冠状病毒科的单股RNA病毒，是猪传染性胃肠炎(TGE)的病原体。TGE是以猪的严重腹泻、呕吐和脱水为特征的一种急性高度接触性传染病。ＴＧＥＶ基因结构研究表明,ＴＧＥＶ基因组主要由纤突糖蛋白(Ｓ)、整合膜蛋白(Ｍ)、核衣壳蛋白(Ｎ)、小结构蛋白(Ｓｍ)组成。其中Ｎ蛋白在不同地区的ＴＧＥＶ分离株中均高度保守,这为以Ｎ蛋白作为该病的诊断提供了理论基础;另外,Ｎ蛋白还在病毒的致病性及病毒复制和转录过程中发挥重大作用。NP具有多种功能，可能也诱导产生抗体。为了高效表达重组融合N蛋白，研究它的抗原性，我们用ＲＴ?ＰＣＲ方法从ＴＧＥＶ扩增出1124 bp的目的片段, 亚克隆于pQE30原核表达载体,利用6个组氨酸作为报告基因和纯化选择标志，实现在大肠杆菌中的大量表达。

1 材料与方法 ?

1.1 TGEV、XL1?Blue 由韩国忠南国立大学校，兽医科大学传染病教研室提供。pQE30在美国的Qiagen公司购买。?

1.2 引物设计和基因克隆〓根据GenBank TGEV的DNA序列，设计了NP基因的一对引物，上游引物：5′?CGC〖ZZ(Z〗GGA TCC〖ZZ)〗 GCC AAC CAG GGA CAA?3′);下游引物：5′?CGCTTA GTT CGTTAC CTC ATC AAT?3′(登录号：M14878, positio

n: 335?1483)，其中包含限制性酶切位点?Bam?HI和?Sac?I（下划线部分），由美国的CoreBio公司合成。以TGEV的mRNA为模板，RT?PCR扩增NP基因，PCR产物及载体pQE30经?Bam?HI和?Sac?I双酶切后,用DNA纯化试剂盒（Promega公司）分别回收，T4DNA连接酶连接回收的片段，构建重组质粒pQE30?TN，转化到大肠杆菌XL1?Blue，经氨苄青霉素筛选及PCR鉴定。?

1.3 NP基因在中的的表达〓利用热激法将重组子pQE30?TN质粒转化到大肠杆菌XL1?Blue中，按照Qiagen公司的说明书对NP进行高效表达。首先，用过夜培养的新鲜细菌接种到100ml的LB肉汤中，加入氨苄青霉素至终浓度100 μg/ml，然后在37℃震荡培养，直到Abs600达到0.5～0.6时，取?2ml?细菌作为诱导前的样品，再加入诱导剂IPTG(Sigma,USA)至终浓度10 μM,细菌移入30℃培养箱继续震荡培养，在诱导后3h和5 h时各取2 ml菌液，4 000 g离心10 min收获细菌样品以便检测。蛋白的浓度用Bradford方法检测。?

1.4 重组NP的纯化〓重组子pQE30?TN按照以上方法大量表达，纯化的步骤按Qiagen公司说明书进行，收获的细菌悬浮在2ml的裂解液中（50 mmol NaH?2PO?4,pH 8.0;300 mmol NaCl;10 mmol imida?zole;1mmol PMSF,均购于Sigma，USA），然后超声波破碎细菌（3 min

., 30 s. 间隔；4℃；30% amplica?tion,Sonic & Materials Inc.）,裂解液10000 g，30 min，取上清保存。取0.5 ml Ni?NTA 琼脂糖(Qia?gen,USA)用新鲜的平衡缓冲液平衡，再用洗涤缓冲液（50 mmol NaH?2PO?4, pH 8.0;300 mmol NaCl;20mmol imidazole）洗涤1次，加入保存的上清液，4℃冰箱中结合过夜。最后用2ml的洗涤缓冲液洗涤4次，留沉淀。沉淀用洗脱液（50 mmol NaH?2PO?4,pH 8.0;300 mmol NaCl;250mmol imidazole）洗脱4次，留每次的洗脱液以供检测。?

1.5 SDS-PAGE和Immunobloting为了检测表达产物及纯化效果，进行了常规的SDS?PAGE，考马斯亮蓝R250染色；用报告基因蛋白（组胺酸）的抗体进行了常规的Western?blotting,进一步确定了表达纯化产物。?

1.6 兔抗NP多克隆抗体的免疫原性 纯化后的重组N蛋白以每公斤体重100 μg的量免疫两只家兔。按照说明书，N蛋白中加入1 mlPBS，再加入等体积的ISA720(Seppic,France)，充分乳化，在家兔四肢多点注射。2周后，同样的方法加强免疫1次。间隔两周，采取1ml兔血，采用Western?Blotting进行检测。然后根据检测结果，分离血清抗体。?

2 结果

２.1 重组质粒的构建及鉴定 RT?PCR产物经１％琼脂糖凝胶电泳，1124bp处出现一条特异的DNA条带（图1），其大小与预定的相符。PCR产物经?Bam?HI和?Sac?I双酶切后直接与经同样酶切的pQE30载体连接，构建的pQE30?TN重组质粒经PCR扩增后，可见在1124　bp处有一条特异条带，证实了阳性重组质粒pQE30?TN。

２.2 重组质粒pQE30?TN的表达 为了获得高效表达的蛋白质产物，首先进行表达时间过程分析。在IPTG诱导前即０ h, 诱导后３h，５ h分别取样，按照材料与方法中的描述制备上清液。然后对SDS?PAGE后的胶进行考马斯亮蓝R250染色，典型清晰的条带（48kDa）在诱导后３ h，５h出现，而没有诱导的细胞和不含有pQE30?TN的感受态细胞没有此条带（图2A）。为了进一步鉴定上清液中的N蛋白，利用抗组氨酸抗体进行了Western?Blotting。结果只在大概48kDa的位置上有一条带（图2B）,与SDS?PAGE结果相吻合。用Bradford方法检测，蛋白质浓度可达1.0 mg/ml。?

2.3 表达产物的纯化 Ni?NTA纯化目的蛋白质的过程中，4次洗脱液，各1 ml，分别取5μl上样，进行SDS?PAGE考马斯亮蓝R250染色，及利用抗组氨酸抗体进行了Western?Blotting。均在相应位置上出现了表达产物的特异性条带（图3）。用Bradford方法检测，4ml蛋白质浓度可达1.0 mg/ml。

2.4 兔抗NP多克隆抗体的免疫原性免疫兔血清和NP单克隆抗体进行免疫印迹杂交，在相应的位置上出现特异性条带，证明血清中的抗体能够特异性的与表达的N蛋白起反应（图4）。?

3 讨论 ?

试验通过对猪传染性胃肠炎病毒核蛋白基因的克隆,扩增出大小为1124ｂｐ的目的基因片段,将其与表达载体连接,通过酶切鉴定得知与预期结果相一致,表明扩增出的片段为ＴＧＥＶ的Ｎ基因。并进一步对ＴＧＥＶ核衣壳(Ｎ)蛋白进行了成功表达。这对Ｎ基因的进一步研究提供了基础。由于核蛋白的高度保守性及其在致病性和病毒复制及转录过程中的作用,通过其在体外的大量表达,可作为诊断抗原,亦可用其制备抗血清及单克隆抗体,进行疾病诊断;另外,Ｎ基因的克隆与表达,为进一步探讨该病毒的分子致病特性及亚单位疫苗的研制提供了重要的物质基础。?

N蛋白是冠状病毒主要的结构蛋白，是在冠状病毒感染细胞中最丰富的蛋白质，因此，是病毒主要的靶蛋白。在研究中我们发现，能够产生中和抗体的S蛋白在原核细胞中的表达量远远少于N蛋白的表达，无法得到纯化的蛋白质。而NP基因插入到载体pQE30中，与亲合标志6×histidine在一个阅读框架之内，和多聚组氨酸标志的氨基端融合的NP在IPTG的诱导下，在原核细胞中高效表达42kDa的TGEV NP,蛋白质浓度可达1.0mg/ml。?E.coli的特性确保了重组蛋白质的高效表达，然而不是所有的外源基因都可以在这个细胞中有效表达。尽管目前有许多异源蛋白表达系统能够产生重组蛋白质，但是获得纯化的蛋白仍然存在许多问题。重组DNA技术使得特异性亲合标志如6×histidine作为融合蛋白序列加入到外源基因序列中，利用重组融合蛋白具有的亲合标志，采用Ni?NTA金属亲合层析方法方便快捷地纯化出浓度高达1.0mg/ml的NP。由于多聚组氨酸标志分子量小得可以忽略不记，不影响NP的免疫活性，可以获得特异性抗体，并可以和相应的抗原反应。纯化的抗原也可以和抗NP单克隆抗体起反应，证明NP重组融合蛋白具有较好的免疫原性。为建立大规模检测TGEV抗体的血清学方法奠定基础。