两种不同培养基对巨噬细胞培养的影响

摘　要：以无血清培养液和培养液分别灌洗小鼠腹腔，后分别吸出灌洗液于胎牛血清和培养液中培养，巨噬细胞吞噬试验检测其活性、台盼蓝测定体外培养细胞的存活率和成层率。结果表明，培养基体外培养的巨噬细胞存活率和成层率高、吞噬能力强，与相比，可作为一种简单而实用的体外分离培养巨噬细胞的培养基。关键词：培养液；巨噬细胞；培养；小鼠巨噬细胞是哺乳动物机体最重要的免疫细胞之一，可通过其强大的吞噬、杀伤、消化降解功能及抗原递呈功能参与机体非特异性和特异性免疫应答，巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验常用免疫增强药物活性的测定，其中体内法存在一些缺点，一是小鼠用量多、费时、费力，二是注射药剂难准确到达腹腔部位，三是常使用一些诱导剂(淀粉肉汤、蛋白胨)，干扰了小鼠吞噬能力，而体外分离培养法简单、快速、省力。对于巨噬细胞的体外培养常用RPMI-1640和DMEM两种培养基，本试验为进一步研究两种不同培养基对体外培养巨噬细胞的影响，旨在找到一种经济、实用的分离培养巨噬细胞的培养基。

1　材料与方法

实验动物7周龄～10周龄的昆明种雄性健康小鼠40只，购于菏泽医学专科学校动物实验室；健康母鸡1只，购于菏泽市养鸡场，在菏泽学院生命科学系实验室常规饲养1周。

试剂和仪器RPMI-1640培养基，DMEM培养基，胎牛血清，Giemsa染料，二氧化碳培养箱，24孔细胞培养板，倒置显微镜及照相系统。

培养液的配制1.3.1　RPMI-1640细胞完全培养液配制　RPMI-1640培养液加入青霉素1×105单位/L，链霉素100mg/L，正压过滤；使用时加入150 mL/L浓度为100 mL/L的胎牛血清。

1.3.2　DMEM细胞完全培养液配制　DMEM培养液加入青霉素1×105单位/L，链霉素100 mg/L，正压过滤，使用时加入150mL/L浓度为100 mL/L胎牛血清。

1.3.3　RPMI-1640和细胞维持液配制　RPMI-1640培养液加入青霉素1×105单位/L，链霉素100mg/L，正压过滤；使用时加入150 mL/L浓度为20 mL/L胎牛血清

1.3.4　DMEM细胞维持液配制　DMEM培养液加入青霉素1×105单位/L，链霉素100 mg/L，正压过滤，使用时加入150mL/L浓度为20 mL/L胎牛血清。

巨噬细胞存活率的测定取RPMI-1640和DMEM完全培养液培养的巨噬细胞放入24孔细胞培养板中，在体积分数为5%CO2培养箱中分别培养12、24、36、48 h后，用4 g/L台盼蓝比较，血球计数板计数。

巨噬细胞存活时间的测定巨噬细胞培养48 h后，换细胞维持液分别培养24、48、72、96、120h，用倒置显微镜观察细胞成层情况(以75%细胞保持完整细胞层计为成层孔)，计算细胞成层率，细胞成层率＝细胞成层孔数/细胞总孔数×100%，比较细胞存活时间。

巨噬细胞的吞噬试验1.6.1　体内法　取20只小鼠腹腔注射1 mL鸡红细胞悬液、随机各取5只分别30、45、60、90min后颈椎处死小鼠，无菌注射2 mL生理盐水到腹腔中揉匀5 min后取腹腔液，调细胞浓度为2×105/mL，取300μL于载玻片上置湿盒内，37 ℃培养箱中贴附30 min，取出后用37℃预热的PBS(磷酸缓冲液)冲洗未被吞噬的鸡红细胞(切勿用力过大使巨噬细胞被冲掉)，立即置甲醇溶液中固定3min，用吸水纸从玻片边缘吸除大部分甲醇后自然晾干，然后Giemsa染色20 min，自来水冲洗去多余染液后晾干观察。

1.6.2　体外法　各取10只小鼠颈椎处死小鼠，分别无菌注射2mL无血清DMEM培养液和无血清RPMI-1640培养液到腹腔中揉匀，5min后取腹腔液，10只小鼠的细胞混合在一起，调细胞浓度为2×106/mL，放入各完全培养基待用。分别取1 mL2×106/mL的巨噬细胞悬液和10 mL/L鸡红细胞悬液1 mL于无菌的离心管中，37 ℃分别培养30、45、60和90 min (5 min摇匀1次)，然后取300 μL到干净的载波片上37 ℃贴附30 min，取出后用37℃预热的PBS(磷酸缓冲液)冲洗未被吞噬的鸡红细胞(切勿用力过大使巨噬细胞被冲掉)，立即置甲醇溶液中固定3min，用吸水纸从玻片边缘吸除大部分甲醇后自然晾干，然后姬姆萨染色20 min，自来水冲洗去多余染液后晾干待观察。

统计学分析试验数据用Spss1.0软件处理。

2　结果

不同培养基对巨噬细胞存活率的影响DMEM培养基和RPMI-1640完全培养基培养的巨噬细胞随着培养时间的延长，巨噬细胞的存活率都在下降，在前24h培养中，两种不同培养基培养的巨噬细胞存活率下降不显著，当培养到36h，两者培养的细胞存活率差异显著(P<0.05)，特别是在培养48h，RPMI-1640培养基培养的巨噬细胞成活率下降至60%，而DMEM培养基培养的巨噬细胞成活率仍不低于75%(图1)。

图1　不同培养基培养巨噬细胞的成活


Fig.1　Survival rates of macrophages in different media



不同培养基对巨噬细胞吞噬活性的影响DMEM培养基培养的巨噬细胞在30、45、60min吞噬率基本接近于体内对照(P>0.05)，但当培养到90min时其吞噬率差异显著(P<0.05)；而RPMI-1640培养基培养的巨噬细胞和体内对照相比，除第60min时与对照相接近外，其他3个时间点其吞噬率都显著低于对照(P<0.05)，见图2。图中1代表体内对照；2代表DMEM培养基；3代表RPMI-1640培养基，下同。由图3可知，DMEM培养基和RPMI-1640培养基在不同时间段巨噬细胞的吞噬指数显著高于体内对照P<0.05)，可能原因是在体外巨噬细胞和鸡红细胞接触面积大，同时受其他因素影响也小，但总体来说，DMEM培养基培养巨噬细胞的吞噬指数比RPMI-1640培养基稍高(P>0.05)，见图3。

不同培养基对巨噬细胞成层率的影响RPMI-1640细胞维持液和DMEM细胞维持液对巨噬细胞成层率的影响随培养时间的延长都逐渐在下降(图4)，但DMEM细胞维持液培养巨噬细胞的成层率下降较缓慢，当培养到120h时，巨噬细胞的成层率下降为21%，而RPMI-1640细胞维持液下降为10%。

图2　巨噬细胞的吞噬率的变化曲线

Fig.2　Variation curves of phagocytic percent of macrophages

图3　巨噬细胞的吞噬指数的变化曲线

Fig.3　Variation curves of phagocytic index of macrophages


图4　不同培养基对巨噬细胞成层率的影响

Fig.4　The effect on stratification rates of macrophages indifferent media
3　讨论

随着体外分离培养细胞技术的发展，巨噬细胞的提取方法有多种细胞来源，有猪、兔、大鼠、小鼠等，又由于研究目的不同，在体内提取细胞的部位也不尽相同，如提取肺血管巨噬细胞、肾小球巨噬细胞，髓基质巨噬细胞、腹腔巨噬细胞等。

在体外细胞培养中，RPMI-1640培养液和DMEM培养液是两种比较常见的培养液，胡庭俊等利用RPMI-1640培养液分离培养小鼠巨噬细胞来研究黄芪多糖对小鼠免疫细胞信号NO的影响；王炳云等利用RPMI-1640培养液分离培养鸡脾淋巴细胞，通过淋巴细胞转化试验来研究中草药多糖的免疫调节作用；尹美珍等利用DMEM培养

液分离培养小鼠腹腔巨噬细胞并研究其细胞因子；黄奔等利用DMEM培养液添加不同营养成分对小鼠胚胎干细胞培养进行研究，在本试验中，进一步研究这两种培养基对小鼠巨噬细胞培养的影响，与体内对照相比较，DMEM培养基体外培养巨噬细胞比RPMI-1640培养基巨噬细胞存活率和成层率高、且吞噬能力强，因此，可作为体外分离培养巨噬细胞一种可靠、方便和经济的培养液。

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