禽白血病病毒跨膜蛋白在膜融合及免疫抑制中的作用

摘　要：禽白血病病毒(Avian leukosisvirus，ALV)入侵宿主细胞的关键是病毒囊膜与宿主细胞膜的融合，ALV在此过程中采用病毒-宿主细胞膜融合机制，这一机制的关键是病毒与细胞受体结合后跨膜蛋白一系列构象的变化。此外，ALV入侵宿主细胞后会引起严重的免疫抑制，继而引发肿瘤的产生。在对一些与ALV有相同感染机制的病毒的研究中发现，引起免疫抑制的关键区也是跨膜蛋白。因此进一步在分子水平上深入研究跨膜蛋白有助于正确认识病毒侵染的本质，做到更为有效的预防与治疗ALV感染。

关键词：禽白血病病毒；膜融合机制；免疫抑制；跨膜蛋白

禽白血病病毒(Avian leukosisvirus，ALV)发现至今已有近百年的历史，主要引起禽群多种多样的肿瘤和严重的免疫抑制，不仅导致感染禽的生产性能普遍降低、淘汰及死亡，而且还会严重影响蛋(胚)源或鸡源细胞的医学研究和生物制品的发展，从而造成巨大的经济损失。近年来，某些ALV毒株的宿主范围开始扩展，新型病例不断出现，潜伏期逐渐缩短，病死率不断上升，对禽业生产再次构成严重威胁。因此，如何防控ALV是我国乃至全世界亟待解决的问题，有着迫切的现实意义，而开展对ALV跨膜蛋白结构和功能的深入研究，正是解决此问题的根本途径。

1　禽白血病病原学

禽白血病(Avianleukosis，AL)是指由逆转录病毒科甲型逆转录病毒属禽白血病病毒引起的以禽类造血组织中某些细胞成分过度增生为主的一类可传染的肿瘤性疾病，包括淋巴细胞性白血病、成红细胞白血病、成髓细胞白血病和髓细胞白血病。由于禽白血病病毒与禽肉瘤病毒在理化特性、病毒形态及致病性等方面具有许多相同的特征，因此常常统称为禽白血病/肉瘤病毒。

根据病毒中和试验、宿主范围以及囊膜糖蛋白的特性等，将禽白血病/肉瘤病毒划分为AJ10个亚群，这10个亚群拥有相似的病毒结构。禽白血病/肉瘤病毒整个病毒粒子直径80 nm～130nm，具有独特的3层结构。最内层是基因组核蛋白复合物；中层为20面体衣壳，由RNA和非糖基化结构蛋白组成；最外层是囊膜，由囊膜蛋白和病毒脂质膜构成，其中囊膜糖蛋白由gp85编码的表面蛋白(SU)和gp37编码的跨膜蛋白(TM)两个亚单位构成。另外病毒囊膜上还有放射状纤突，直径约为8nm(图1)。病毒的基因组为二倍体，由两个线状正股单链RNA组成。病毒结构基因从5′端至3′端为gag-pol-env，分别编码病毒结构蛋白，RNA依赖的DNA聚合酶(逆转录酶)和囊膜糖蛋白。

2　禽白血病病毒囊膜蛋白及跨膜蛋白结构

早期的研究发现，病毒的囊膜与致病力相关，因为囊膜上有两种病毒基因编码的蛋白亚单位，它们与病毒的感染密切相关。这两种囊膜糖蛋白亚单位是SU和TM，球形结构的SU与杆状的TM两者由二硫键相连成二联体，附着于病毒囊膜上。它们的共同特点是均形成同源三聚体复合物(图2)。现已知道，这种三聚体结构对维系病毒囊膜蛋白的完整性，尤其是隐藏融合肽十分重要。其中SU分子质量为36ku，含有病毒-受体决定簇，用于识别及结合到宿主细胞的特异性受体上，决定亚群特异性和宿主范围。但是SU作用的发挥需要通过另一蛋白定位在细胞膜上，这一关键的蛋白就是TM。

图1　禽白血病病毒结构模式图

Fig.1　The substructure pattern of ALV

图2　SU与TM三聚体

Fig.2　The trimer of SU and TM

TM为Ⅰ型融合蛋白，分子质量为21ku。该蛋白有胞外区、跨膜区和胞内区3个功能区。胞外区与表面蛋白结合，具有gp85结合区和能介导病毒与细胞膜融合的融合区，融合区内部还有两个明显的七肽重复区(HR1和HR2)。跨膜区一般由20个～25个疏水性氨基酸组成，促使整个Env蛋白定位于细胞膜上。胞内区则位于gp37的C端，一般由20个～30个氨基酸组成(图3)。随着基因组学和蛋白质组学的飞速发展，科学家们对反转录病毒TM内的结构有了进一步的了解，发现其结构从N端到C端包括6个区域，即外展疏水区、卷曲螺旋序列(包括折叠的免疫抑制区ISU)、一个短的二硫键环、一个变动的胞外片断(含有抗体反应区ARD)、跨膜疏水区、胞浆内区。

图3　禽白血病病毒囊膜蛋白结构示意图

Fig.3　Membrane protein pattern of ALV

3　跨膜蛋白在膜融合过程中的作用

3.1　病毒受体

病毒受体对于病毒特异的感染宿主细胞具有重要意义。ALV的入侵就是通过表面糖蛋白与细胞膜上的相应受体结合后开始的。在ALV中，除J亚群的受体为嗜髓样肿瘤细胞表面的抗原，其他亚群病毒的受体为B淋巴细胞的表面抗原。其中A亚群的受体是一类低密度脂蛋白相关蛋白，由tv-a基因编码；B、D、E亚群受体相同，属于肿瘤坏死因子受体家族，由tv-b基因编码；C亚群受体是嗜乳脂蛋白，属于免疫球蛋白大家族，由tv-c基因编码；J亚群的受体是I型Na＋/H＋交换蛋白(chNHE1)，由位于23号染色体上的基因编码。据推测在相同亚群内使用相同的受体，这种亚群特异性受体是由SU亚单位上约150个氨基酸组成的3个可变亚区vr1、vr2、vr3决定的。

3.2　融合肽

ALV在N端的外展疏水区的末端有一段由13个～24个氨基酸组成的融合肽，此区富含甘氨酸残基，在介导膜融合过程中发挥重要作用，为病毒融合的功能单位。融合肽内部的七肽重复区HR1和HR2能够形成反向平行的六螺旋束结构，从而迫使病毒膜与细胞膜拉近，被认为是融合蛋白融合后构象的核心结构。研究发现很多反转录病毒科病毒的HR1和HR2之间的linker部分存在一个保守的半胱氨酸基序CX6CC，其第一个半胱氨酸与第二个半胱氨酸形成一个分子内二硫键，该键在稳定反向平行结构中起到重要作用。

3.3　膜融合过程

膜融合机制即病毒表面糖蛋白结合到宿主细胞受体后，启动了病毒融合蛋白的一系列构象变化，从而使病毒粒子释放到宿主细胞内。ALV的融合肽在膜融合的早期就与宿主细胞膜相互作用，随后膜蛋白构象发生变化，糖蛋白前体的裂解形成多聚体，从而使蛋白复合物进入亚稳定状态，以便启动融合，但此时融合肽还没有暴露，当病毒结合到宿主细胞的受体时便发生构象变化，暴露出融合肽。由于融合肽内两个七肽重复区同源物之间有高度亲和力，促使HR1和HR2形成稳定的六螺旋束结构，从而将病毒膜和宿主细胞膜拉近，此过程释放出来的能量进一步促进两膜融合，最终完成病毒生命周期的第一步，也是关键的一步——融合这一过程。目前存在一种假说，Ⅰ型病毒膜融合可能至少经历融合蛋白的3个不同构象，即天然构象、中间体构象和融合后六螺旋束构象。中间体又称“前发夹结构”，形成于受体结合后，发夹三聚体形成前。更多的晶体结构解析，将有助于对这些构象的本质及其意义有更进一步的认识。

与禽白血病病毒有相同感染机制的艾滋病病毒融合肽内也存在两个七肽重复区，根据其相互作用机制，科学家们研制出了第一代抗艾滋病病毒融合肽抑制物，该抑制物与HR2的活性相似，可以与TM二级结构HR1竞争性连接，阻止了HR1和HR2之间的相互作用，并且抑制了TM构象的变化，从而可以强有力的选择性抑制病毒和细胞的融合。因此设置具有稳定结构的HR组合肽，可以有效阻止病毒对细胞的感染。这一研究成果为ALV的防控指明了方向。

4　跨膜蛋白在免疫抑制中的作用

禽白血病病毒可以引起严重的免疫抑制，对重大疫病的流行起到了不可低估的作用。Ellgasard等研究表明，引起免疫抑制的决定因素就在TM内。ALV的TM卷曲螺旋区中存在一个由27个氨基酸组成的高度保守的免疫抑制序列，有人将这种高度保守区命名为免疫抑制区(ISU)。通过不同ALV毒株之间的比较确定，这个保守序列不存在毒株之间的差异。很多动物反转录病毒TM内都有高度保守区，以该区合成的多肽称为免疫抑制性多肽，可以在体内、外抑制淋巴细胞的活性，对免疫抑制机理的研究起到了推动作用。ISU包含了一个亮氨酸拉链区，此区折叠成一个独特的α螺旋，可能和胞外片断内的ARD区具有强烈的相互作用。因此可以推测ISU和ARD之间的相互协调、相互制约的平衡关系可能就是免疫抑制发生与否的关键所在，这也是研究ALV的新的切入点。

由此可见，禽白血病病毒跨膜蛋白在病毒感染以及感染后产生免疫抑制的过程中都发挥着重要的作用。因此对跨膜蛋白结构的正确认识是防控ALV感染的正确途径，也是先决条件。此外ALV是典型的囊膜病毒，与哺乳动物囊膜病毒有相似的发病机理，已成为研究人类囊膜病毒的常用模型，因此深入研究禽白血病病毒的跨膜蛋白不仅能为畜牧业挽回巨大的经济损失，也将为对人类囊膜病毒的研究奠定坚实的理论基础，意义十分重大。