摘 要：不分节段负股RNA病毒(nonsegmented negative-strand RNAviruses，NNSV)属于单负股病毒目，具有许多优良的特性，可以作为活病毒疫苗的候选载体，利用反向遗传学系统，表达外源基因，研发新型疫苗。NNSV载体疫苗的免疫原性，载体的容量，外源糖蛋白对载体病毒生物学的影响，以及插入基因的遗传稳定性等已成为当前活病毒疫苗载体研发的重要课题。
关键词：活疫苗载体；不分节段负股RNA病毒；反向遗传系统
选择致弱的活病毒作为疫苗，主要是因为其能表达病毒抗原的完整组分，诱导广泛的局部免疫和系统免疫，提供持久的保护力。在某些特定的情况下，致弱的活病毒疫苗也有一些缺点：一些病毒不能作为减毒活疫苗，如能引发持续性感染的人免疫缺陷病毒(Humanimmunodeficiencyvirus，HIV)，高致病性的埃博拉病毒；一些病毒在体外试验中生长不佳，如人乳头瘤病毒和丙型肝炎病毒；一些高致病性的病毒在疫苗研制过程中存在安全隐患，如严重急性呼吸道综合征冠状病毒(Severeacute respiratory syndromecoronavirus，SARS-CoV)和埃博拉病毒；一些病毒会由于物理不稳定性而失去感染力，如人呼吸道合胞体病毒(Humanrespiratory syncytialvirus，HRSV)；一些病毒能与正在流行的病毒株发生基因交换，如冠状病毒、流感病毒和肠道病毒等。然而，合适的载体疫苗可以克服这些不利因素。特定的候选病毒载体的生物学特征还可能提高免疫效力。载体疫苗另一个主要优点是能够较快地构建疫苗，预防新出现的高致病性病毒病。在这种情况下，对新出现的病原序列进行分析，鉴定出可能的保护性抗原，然后将它们的cDNA克隆插入到预先已检验过的、有广泛临床用途的载体中，可以加快疫苗的研发速度。
1 NNSV成为疫苗载体的潜力
选择NNSV作为病毒载体是由于NNSV有许多优良的特征。许多动物、禽类和人的NNSV，已经过全面的研究鉴定，表明可以用作疫苗载体。一些动物或禽类的NNSV，如水疱性口炎病毒(Vesicularstomatitis virus，VSV)和新城疫病毒(Newcastle diseasevirus，NDV)，在抗原性上与常见的人类病原迥然不同。因此，整个人群应该对感染和免疫都比较敏感。一些人类的NNSV，如人副流感病毒1,2和3型(Humanparainfluenzavirus，HPIV)在易感人群中具有成为疫苗载体的潜力。例如，婴儿和儿童未曾接触过HPIV-1,2和3，因此，减毒的HPIV-1,2和3都可以开发成为适用于儿童接种的疫苗载体。
人们对减毒的NNSV生物学活性了解也比较多。由于自然宿主范围的限制性，一些动物或禽类病毒在灵长类动物体内会出现毒力减弱的现象。如果研究鉴定出与病毒毒力减弱相关的突变，那么可以运用反向遗传技术进行修饰改造。因此，能够以减毒的NNSV作为载体表达异源性病毒保护性抗原，从而在定向的免疫群体中能很好地平衡毒力减弱与免疫原性之间的关系。作为载体的NNSV在细胞中能高效地繁殖，例如在适合于人用疫苗生产的Vero细胞上。大多数的NNSV能够通过鼻腔内途径高效感染，有效地诱导局部的IgA和系统的IgG抗体免疫应答以及细胞介导的保护性免疫应答。鼻腔内疫苗可以简便、安全地进行接种，从而便于在疾病暴发或流行时快速进行。鼻腔内疫苗对于经呼吸道感染和传播的病毒尤其有效，如对SARS-CoV和流感病毒等。作为载体的NNSV只在细胞质中增殖，不会整合到宿主细胞基因组中，因此不会造成细胞转化。NNSV之间发生基因交换的机率非常罕见，而且在自然界中还没有报道。NNSV编码5到11种不同的蛋白质，而大DNA病毒，如痘病毒，编码多达200种蛋白质。这些复杂的病毒表达的几种蛋白质能调节或颉颃宿主免疫应答，从而可能降低疫苗的免疫效力。麻疹病毒是一种具有强免疫抑制的NNSV，是由另一种机制介导，而非干扰素机制介导，因此，不太适于作为载体候选病毒。复杂的载体抗原可能会稀释针对外源性抗原的抗体和细胞介导的免疫应答，导致T记忆细胞总群数量的降低。NNSV的基因组是由多个不重叠的(绝大部分来说)、以单个不同的mRNA单位进行表达的基因组成，因此，构成了一个可调节的基因组结构，便于外源基因的插入以及维持外源基因的稳定性。
2 NNSV载体疫苗的构建
2.1 反向遗传技术
NNSV的反向遗传操作技术是指在体外通过构建RNA病毒的感染性分子克隆，将病毒基因组RNA逆转录成cDNA，在DNA分子水平上对其进行各种体外操作，由病毒基因组和各种辅助蛋白来组装成新的有感染性的RNA病毒的一项研究技术。NNSV反向遗传的核心就在于构建有功能性的核糖核蛋白(ribonucleoprotein，RNPs)。功能性的核衣壳成分是由全长基因组或反基因组RNA和参与复制、转录的主要蛋白质，即核衣壳蛋白(nucleoprotein，N或NP)、磷蛋白(phosphorprotein，P)以及大聚合酶蛋白(largeprotein，L)组成的。将编码病毒功能性的核衣壳成分的质粒转染细胞，就可以从克隆的cDNA中拯救出有感染性NNSV。此外，HRSV和丝状病毒科马尔堡病毒或埃博拉病毒的拯救还分别需要转录延伸因子M2-1或转录活化因子VP30。通过转染将质粒运送到支持特殊的病毒复制的细胞系。质粒的表达是由T7RNA聚合酶指导的。有3种途径可以实现：①与表达T7RNA聚合酶的重组痘苗病毒共感染；②利用稳定表达T7RNA聚合酶的细胞系；③共转染表达T7RNA聚合酶的质粒。第3种方法最受欢迎，因为它能够使病毒可以在用于疫苗生产的细胞系(如Vero)中拯救，而不需要添加其他使基因表达调控复杂化的成分(如痘苗病毒)。这些RNA和蛋白质成分的细胞内表达引起病毒核衣壳的组装，组装的核衣壳成分具有基因表达和基因组复制的功能，因此，建立了生产性感染，产生感染性病毒。
2.2 表达外源基因的减毒野生型NNSV
最简单的载体策略就是将一个或多个外源抗原基因插入到有复制功能的NNSV中，然后从中表达一个或多个外源性抗原。NNSV载体必须是显著致弱的，才能安全地用于人类或动物。例如NDV，由于自然宿主限制性，在灵长类动物中是减毒的，其野生型病毒可直接作为疫苗载体。
其他的NNSV在用作人类潜在疫苗载体前需要利用反向遗传技术进行致弱。例如，VSV不是一个普通的人类病原，但VSV感染与一些疾病相关，尽管这些病通常对于人是轻微的。因此，在VSV用作疫苗载体前，需要致弱并进行细致的临床评价。另外一个例子是HPIV-3，能引发人类产生呼吸道疾病。因此，在使用的时候，必须制备减毒的毒株，并证实其安全性。
NNSV的致弱可以运用多种策略来实现，病毒基因在基因组中的次序可以重排，产生一个最佳水平的基因表达，从而降低了病毒复制的效率。鉴定与毒力相关的核苷酸或氨基酸，然后利用反向遗传技术对其进行点突变，再以理想的组合引入到病毒基因组或蛋白质中，也可以通过对相关病毒的序列进行比对，鉴定出点突变，然后利用反向遗传技术将这些点突变在相关病毒中传递。缺失或者沉默非必需的辅助基因，包括那些编码干扰素颉颃蛋白质的基因，通常会产生减毒的重组病毒。对于狂犬病毒而言，可以将G糖蛋白细胞质尾部结构域部分截断，从而有效的降低其复制，但不会显著削弱其免疫原性。外源基因的插入，常常具有减毒效应。致弱也可以通过交换相关的人类和动物或者禽类病毒之间内部蛋白基因而引入宿主范围限制性来实现。
2.3 抗原嵌合病毒
从插入的基因中表达外源抗原的另一种策略就是用致病性病毒的目的基因替代载体的主要的保护性表面抗原。这些构件被称为抗原嵌合病毒。只有外源的表面蛋白有效地掺入到病毒颗粒中以及在载体下有功能性，所拯救的抗原嵌合病毒才能存活。
几个很典型的抗原嵌合病毒就是以VSV作为载体的，用流感病毒的血凝素糖蛋白(hemagglutinin，HA)或者埃博拉病毒、马尔堡病毒或者拉沙病毒的各自的糖蛋白将VSV的G糖蛋白替换。在体外，构建的嵌合病毒，相对于亲本VSV毒力减弱，表明载体蛋白与外源糖蛋白之间存在一定程度的不兼容性，但VSV的复制效率没有明显改变。并非所有以VSV做载体的嵌合病毒都具有复制功能。HRSV的每一个蛋白都可以掺入到VSV病毒颗粒中，在体外试验中单独的融合蛋白(fusionprotein，F)也足以赋予HRSV有效的感染性和生长能力，但VSV的G蛋白为HRSV的G或F蛋白所替代后构建的嵌合病毒是不能存活的。
用HPIV-1的HN和F糖蛋白取代HPIV-3中相应的基因，拯救出的嵌合病毒在体内和体外试验中复制效率和野生型病毒相当。这种嵌合并没有引起病毒毒力下降，可能反映了这两种病毒之间关系相近，和这一观点一致的是，用遗传距离较远的HPIV-2的(HN)和F蛋白取代HPIV-3中相应的基因，并不能拯救出活的嵌合病毒。对HPIV-2的HN和F蛋白进行一定的修饰，用HPIV-3的HN和F蛋白细胞质结构域取代HPIV-2的HN和F蛋白相应的结构，可以拯救出活的抗原嵌合病毒，虽然在体内试验中毒力减弱，但在体外试验中可以有效地复制。因此，异源性糖蛋白在抗原嵌合病毒中高效的发挥功能依赖于其细胞质结构域与载体病毒的匹配性。
抗原嵌合病毒涉及到用人HPIV-3的HN和F基因替代牛副流感病毒3型(Beef cattle parainfluenza virus3，BPIV-3)的HN和F表面糖蛋白基因，BPIV-3对于人类而言，由于自然宿主范围的限制性，毒力是减弱的。这将BPIV-3的宿主范围的限制性与HPIV-3的主要抗原决定因素结合起来，拯救出减毒的牛-人嵌合PIV-3(B/HPIV-3)，在体外的复制效率并没有降低，仍然保持对非人的灵长类动物宿主致弱的表型。
2.4 表达外源基因的抗原嵌合病毒
除了直接作为活疫苗，抗原嵌合病毒也可以用来表达外源性抗原。例如，B/HPIV-3嵌合病毒可以作为载体，插入外源的HRSV或者HMPV保护性抗原基因，分别表达这些病毒的保护性抗原。这些应用可以构建出双价疫苗，针对HPIV-3和HRSV或者HPIV-3和HMPV。表达HRSV的F糖蛋白的B/HPIV-3嵌合病毒正在进行临床试验。
2.5 外源基因插入到NNSV的基因组中
典型的NNSV基因组模块式结构组成，转录起始于3′基因末端，病毒聚合酶在基因起始(gene start，GS)和基因终止(geneend，GE)信号的指导下，依次复制基因。GS和GE构成了每个基因的上游和下游限制区。这些信号分别指导每个基因转录起始和终止/多聚腺苷酸化，产生单个mRNA。病毒启动子存在于基因组(和反基因组)的3′端，长度约为44到96个核苷酸不等，主要取决于不同的病毒，每个GS和GE信号通常由8个～126个核苷酸组长。因此，顺式作用信号是比较短的。
表达外源性抗原的转录单位构建的方法是将外源基因的开放式阅读框的cDNA进行加工，在其两侧加上载体特异性的GS和GE信号序列。再将此转录盒插入到NNSV载体中，侧翼是基因间区域。在拯救的重组NNSV中，外源基因作为额外的独立的mRNA被表达。NNSV能接纳并高效地表达插入到第一个基因前的、或者任何一个基因间区域的、或者最后一个基因之后的外源基因。目前应用比较广泛的是VSV和NDV，以其减毒的病毒株为载体表达各种外源性蛋白，例如前者表达Yersiniapestis的低钙应答蛋白V(low calcium responseprotein，LcrV)，棉尾兔乳头多瘤早期蛋白，HIV的囊膜蛋白(envelope，Env)，丙肝病毒的结构蛋白，后者表达H5亚型禽流感病毒的HA蛋白，SARS-CoV的纤突糖蛋白(spike，S)，RSV的F蛋白。
NNSV的一个分类群具有独特的特征，基因组的长度必须是6的整数倍，才能高效复制。一些研究者认为这反映了核衣壳的严格组成，每一个N单体精确地与6个核苷酸相结合。“6碱基原则”只适用于副黏病毒科副黏病毒亚科，包括仙台病毒(Sendaivirus，SeV)，HPIVs和NDV。此外对于符合“6碱基原则”的病毒而言，由于基因组的六聚体相变，每个GS信号的位置在转录的效率方面有一定的作用。因此，对于这些病毒，插入的长度和组成必须符合“6碱基原则”。
2.6 外源基因插入到基因组中不同位置
NNSV的转录具有一定的极性，启动子近侧的基因比远侧的基因表达的效率更高。因此，当外源基因插入到基因组上游时，表达的效率更高。
由于转录存在极性，一个或多个外源基因的插入，也会降低下游载体基因的表达，可能会降低载体病毒在体内和体外的复制性能。与外源基因插入到启动子远侧相比，插入到启动子近侧对病毒的致弱影响更强，很可能是因为外源基因插入到启动子近侧会影响载体病毒下游许多基因的表达。对NDV和VSV而言，在基因连接点插入外源基因，外源基因插入到N与P基因之间产生的致弱影响最强。这是因为N与P蛋白之间的摩尔比发生变化，N与P蛋白是核衣壳中相互作用的两种蛋白质，外源基因插入对于病毒的转录和RNA的复制有害。
2.7 载体的容量
外源基因插入到NNSV会增加基因组的长度和基因的数目，通常这会对病毒在体内和体外试验的复制性能产生衰减效应，这种影响在体内试验中更明显。这可能是由于外源基因的插入影响了病毒的转录。RNA的复制和包装也可能受到影响，目前对此还未进行深入透彻的研究。
2.8 插入基因的毒性
在一些情况下，表达的外源糖蛋白似乎是有毒性的，能强烈地减弱NNSV载体的复制。在体外生长时，这些外源基因快速积累突变，产生变化的蛋白质，降低表达水平，或完全停止表达。插入的外源基因与载体的毒性组合的例子有HPIV-1的HN蛋白插入到HPIV-3基因组中，可能具有抑制性，因为它会包装到载体病毒粒子中，由于存在相似性，可能会干扰HPIV-3的HN蛋白；腮腺炎病毒的F基因插入到麻疹病毒中以及麻疹病毒的F蛋白插入到VSV中，也都可能具有抑制性，可能是由于F蛋白具有融合性，也可能是由于F蛋白干扰了载体病毒的糖蛋白。
2.9 插入基因的遗传稳定性
为了使NNSV载体疫苗适合人和动物免疫接种，外源基因在NNSV中必须能够在生产和使用的所有过程都保持稳定。RNA病毒在每一轮复制中平均每一个核苷酸有10－3～10－5错配率。以正股RNA病毒为载体常常会在体外传代过程中很快地完全或部分缺失外源基因。然而，以NNSV为载体插入的外源基因只是比较缓慢地积累点突变，很少会发生基因的缺失。即便外源基因通常保持稳定，对所有疫苗制剂进行监测依然是必要的，必须要确保插入的外源基因的保真性。
2.10 外源糖蛋白对载体病毒生物学特性的影响
NNSV在出芽过程中，从宿主细胞浆膜中获得囊膜，将表面表达的外源糖蛋白掺入到载体病毒颗粒中，抗原嵌合病毒依赖这些外源糖蛋白代替缺失的载体糖蛋白发挥功能。在以VSV为载体的重组病毒中，表达的外源糖蛋白能高效地掺入到病毒粒子中，例如流感病毒神经氨酸酶(NA)和血凝素蛋白(HA)，麻疹病毒的H和F蛋白，HRSV的F蛋白。这些外源糖蛋白以相当于载体G蛋白相对摩尔量的30%水平被包装到病毒粒子上。HIV-1囊膜蛋白是一个例外，只能痕量地掺入到病毒颗粒中，但是如果用VSV的G蛋白的细胞质尾取代HIV-1囊膜蛋白的细胞质尾部结构域，掺入量会显著增加。然而，互换细胞质尾部结构域的方法并不能增加HRSV的F蛋白或CD4表面糖蛋白的掺入量，表明VSV的G蛋白的细胞质尾是非必需的。HRSV的F蛋白和HIV-1囊膜蛋白在VSV囊膜上是有功能的，能够以不依赖于载体G蛋白的方式起始感染。因此，就掺入的外源性表面蛋白而言，VSV病毒粒子似乎是不加区别的，在大多数例子中，这似乎与结构的或分类的相关性或者VSV细胞质尾的存在无关。
研究者对PIV病毒载体表达的外源糖蛋白掺入到病毒粒子展开了相关的研究，结果与VSV的研究略有差异。重组SeV表达的HRSV的G蛋白或者B/HPIV-3表达的SARS-CoV纤突S蛋白并不能显著地掺入到病毒颗粒中。然而，HPIV-1的HN蛋白能掺入到HPIV-3病毒粒子中，的确干扰了载体的复制。这可能是因为HPIV-1与HPIV-3的相关性很高的缘故。可是，相近的分类/序列联系对于掺入并非必需的，因为HPIV-1表达的HMPV的F蛋白能有效的掺入到病毒粒子中，HPIV-3表达的埃博拉病毒GP糖蛋白也能掺入到病毒粒子中。
将外源糖蛋白掺入到载体病毒颗粒中可能会改变载体病毒的嗜性或载体在宿主内的传播能力，这可能会引起高致病性病原的毒力增强。但现有研究数据还没有证实这一点。表达HIV-1囊膜糖蛋白的重组VSV和表达埃博拉病毒，马尔堡病毒，或拉沙病毒的GP蛋白的抗原嵌合VSV已经在非人的灵长类动物上进行临床评估了。表明是安全致弱和具有免疫原性及保护力的。这表明在总体水平上，外源糖蛋白并不会显著增加载体的毒力。
3 NNSV载体疫苗的免疫原性
有几种因素影响载体疫苗的免疫原性。
首先，任何活病毒疫苗的免疫原性和保护效力的水平都依赖于其复制水平。因此，由于减毒而引起复制能力下降，会导致免疫原性下降。将病毒致弱，以保证疫苗的安全，同时也使其保持一定的复制水平，可以产生较好的免疫原性，但这是具有挑战性的，最终还得依赖于临床评估。载体的扩散与免疫应答的诱导和基因组RNA的持续存在相关。
第二，影响疫苗免疫效力的因素是所表达的病原抗原的种类。典型的载体疫苗只表达一个或两个靶病原的蛋白，通常是表面糖蛋白，而减毒的病原表达全部的病原抗原。尽管中和抗原能有效诱导产生病毒中和抗体，但和相对减毒的全病原相比，病原抗原的种类减少很可能会降低细胞介导的免疫应答，
第三，载体表达的外源糖蛋白的免疫原性也受到其是否掺入到载体病毒颗粒上的影响。这反映了颗粒抗原要比可溶性抗原的免疫原性更强，尤其是能介导与抗原递呈细胞结合。此外，与坏死或凋亡所介导的病毒释放相比，病毒粒子结合蛋白能更快地从感染细胞中释放。例如，用NDV的F蛋白的细胞质尾和跨膜区结构域替换H7亚型禽流感病毒的HA糖蛋白的相应区域，然后将此嵌合的HA插入到重组NDV中表达，与表达未修饰的HA蛋白的重组病毒相比，该重组病毒可以增加蛋白掺入到病毒颗粒中的量，增强免疫应答，提高对流感病毒的保护效力。另一个例子是，通过用VSV的G蛋白细胞质结构域替换HIV囊膜蛋白的相应区域，可以增加HIV囊膜蛋白掺入到重组VSV颗粒中，增强了其免疫原性。
第四，共表达的免疫刺激因子，如γ干扰素、IL-2、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和色素C等会影响NNSV载体的免疫原性。在一些情况下，共表达免疫刺激因子会使NNSV载体致弱，但允许其保持免疫原性。在另外一些情况下，免疫应答的强度也会因为共表达的分子而增强，如表达巨噬细胞粒细胞集落刺激因子的抗原嵌合病毒B/HPIV-3和表达IL-2的RV。重组RV表达促凋亡蛋白色素C使病毒的毒力减弱，但提高了其免疫原性，该效应的产生增强了抗原递呈细胞捕获凋亡细胞的能力。
第五，NNSV载体也提供了加强免疫的策略。在用减毒活疫苗免疫之后，如再用载体疫苗免疫，降低了免疫效力，因为针对首次接种的免疫应答限制了随后疫苗的复制和免疫原性。然而，再次免疫的效力可以通过使用不同载体的疫苗来改善。例如，与用同一病毒进行两次免疫相比，分别用表达HIV-1囊膜蛋白的RV和VSV进行第一次和第二次免疫，会显著增强细胞免疫应答和体液免疫应答。HPIV具有4种血清型，为在儿童群体中进行连续接种提供了可能性。
第六，可以对载体进行修饰，使其可以携带一套表面抗原。例如，构建3种VSV重组病毒每个都携带不同血清型VSV的G糖蛋白。研究表明依次用这3种载体疫苗免疫，每一种疫苗表达HIV-1Env或联合表达Env和群抗原蛋白(groupantigen，Gag)，可以加强免疫应答。HPIV-3的HN和F表面蛋白也可以与HPIV-1和2病毒的表面蛋白交换。然而，这些糖蛋白交换载体含有一套不变的内部蛋白，用它们来免疫，可以诱导针对内部蛋白的细胞介导的免疫应答，细胞免疫赋予了对重新感染的抵抗能力，但这种免疫在几月内就消失了，因此，需要考虑另一方法，就是连续免疫。
最后，NNSV载体疫苗也能用于加强由活病毒疫苗诱导的免疫应答。用减毒的HRSV毒株免疫后，再用表达HRSV的F蛋白的HPIV-1载体疫苗加强免疫，要比接种两次减毒的HRSV毒株的免疫原性更强。如果用不同的接种途径连续免疫，那么加强免疫也可能更有效，如首先肌内接种VSV载体疫苗，然后再鼻腔内接种NDV载体疫苗。
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