猪皮炎肾病综合征组织病理学和PCR诊断

摘　要：应用病理学和PCR方法，对浙江某猪场送检的疑似猪皮炎肾病综合征(PDNS)病猪进行诊断。结果发现肾脏呈现纤维蛋白性肾小球肾炎变化，真皮及皮下血管表现为坏死性脉管炎，淋巴组织中大量淋巴细胞缺失、多核巨细胞浸润，PCR扩增产物显示猪圆环病毒2型(PCV-2)阳性。结果表明，该猪场感染了PCV-2，并表现为PDNS的病理特征。

关键词：猪皮炎肾病综合征；组织病理学；猪圆环病毒2型；聚合酶链反应

猪皮炎肾病综合征(Procine dermatitis and nephropathysyndrome，PDNS)是与猪圆环病毒2型(PCV-2)感染相关的一种新的疾病，据报道，PDNS的发生与PCV-2感染紧密联系在一起。PCV-2最早是1996年Clark等从加拿大的无特定病原(SPF)猪中分离鉴定的，并认为是引起断奶后仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原体。在英国等国家的PDNS发病猪群病死率在0.25%～20%，甚至更高，死亡猪多呈急性肾衰竭，未死亡的病猪一般在发病后7 d～10d康复。近年来我国对猪圆环病毒感染的报道较多，但大多为PCV-2与其他疾病混合感染，而对猪皮炎肾病综合征的病例报道很少，本试验对临床疑似PDNS的1例病猪进行了病理学观察和PCR检测，现将结果报告如下。

1　材料与方法

1.1　动物来源

浙江某猪场饲养长白肉猪400余头，饲养至65kg左右时，10头猪后肢、会阴、胸、腹和耳朵等部位皮肤开始出现圆形或不规则的红色或紫红色斑块，有的坏死后形成结痂，病猪体温、食欲和精神状态变化不大。其中1头死亡，被送到上海市动物疫病预防控制中心诊断。

1.2　病理学观察

对送检病猪进行大体剖检，观察并记录病理剖检变化。取病变皮肤、肺脏、肾脏、肝脏、脾脏、淋巴结、扁桃体等组织用100mL/L甲醛溶液固定，常规石蜡包埋、切片，苏木素-伊红(HE)染色，显微镜观察。

1.3　PCR检测样品

1.3.1　样品前处理　取病猪肺脏、肝脏、脾脏、肾脏和淋巴结，混样剪碎、研磨、PBS匀浆，7 500 r/min离心5min，取上清液备用。

1.3.2　病毒DNA的提取　按核酸滤膜提取说明书进行，购自香港基因芯片有限公司。取待检匀浆上清液250 μL，加500 μLbuffer V-A混匀，室温静置5 min；加125 μL buffer AP2，和125 μL bufferV-B，颠倒混匀；12 000 r/min离心5 min，取850 μL上清于装有柱子的2 mL离心管中；5 000 r/min离心1min，弃废液，加700 μL buffer W1A；6 000 r/min离心1 min，弃废液，加700 μL bufferW2漂洗液；12 000 r/min离心1 min，弃废液，加700 μL buffer W2漂洗液；12 000 r/min离心1min，将柱子套入一新1.5 mL管，加40 μL buffer TE；室温放置1 min,12 000 r/min离心1min；管中收集的即为提取的病毒DNA，－20 ℃保存备用。

1.3.3　猪圆环毒病的PCR检测　酶及其他PCR所需试剂购自宝生物工程(大连)有限公司。设计特异性引物，预扩增片段大小为1 154bp。上游引物P1：5′-CCGCGGGCTGGCTGAACTT-3′；下游引物P2：5′-ACCCCCGCCACCGCTACC-3′(引物由上海鼎安生物有限公司合成)。PCR反应体系：10×PCRbuffer(含MgCl2)2.5μL，dNTPs(2.5 mmol/L)2.0 μL，引物(25 pmol/μL)各1μL，TaqDNA聚合酶(5 U/L)0.5 μL，DNA模板4.0μL，加双蒸水至25 μL。PCR反应条件：预变性94 ℃ 5 min；94℃ 1 min，53 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃延伸7 min。取5μL PCR产物在11g/L的琼脂糖凝胶上进行电泳(电压100 V，电泳30 min)，在凝胶成像系统上观察目的片段。

2　结果

2.1　剖检病变

病猪下颌淋巴结、腹股沟淋巴结肿胀、出血，肠系膜淋巴结肿胀、坏死。脾肿胀、出血。肾脏肿大，皮质苍白，髓质水肿。心肌有出血点，心冠脂肪水肿。肺局部实变。腹部皮下有胶胨样渗出。

2.2　组织病理学变化

2.2.1　皮肤　真皮及皮下组织局部呈现弥漫性出血(图1A)，肌肉组织、血管、淋巴管之间充满大量红细胞，还有少量酸性粒细胞、淋巴细胞浸润。小血管管壁破坏严重，呈坏死性血管炎变化，血管壁及血管周围有大量淋巴细胞、酸性粒细胞浸润，红细胞渗透到周围组织(图1B)，血管壁炎症涉及到毛细血管、小血管和中等大小血管。

2.2.2　肺脏　主要呈现间质性肺炎变化。肺泡壁毛细血管充血，肺泡壁增厚，肺泡与肺泡之间间隔增宽，增宽的组织主要由单核细胞、成纤维细胞和水肿液构成(图1C)。支气管和细支气管周围形成具有生发中心的淋巴小结(图1D)。局部肺泡呈代偿性扩张，造成肺气肿。

2.2.3　肾脏　肾小球囊腔充满大量纤维素性物质，均质红染，内含多量崩解的细胞碎片。血管球破坏严重，萎缩甚至完全消失，由炎性细胞、细胞碎片和纤维素样物质组成(图1E)。肾间质有大量淋巴细胞、单核细胞和酸性粒细胞浸润，呈局灶性间质性肾炎变化。大部分肾小管受到不同程度的破坏，肾小管上皮细胞以肿胀、变性和坏死为主，部分变性的上皮细胞胞浆内呈现数量不等、大小不一的玻璃滴样物质，均质嗜伊红，呈典型的玻璃样变性(图1F)；部分肾小管上皮细胞完全消失，只留下一层基底膜，管腔内形成均质红染的无结构性蛋白管型(图1G)。

2.2.4　脾脏　髓质区酸性粒细胞增多，脾小体淋巴细胞减少，生发中心出现少量多核巨细胞(图1H)。

2.2.5　淋巴结　以出血、水肿、淋巴细胞崩解或消失、淋巴滤泡减少为主。淋巴结被膜下出血和水肿最为严重，大量淋巴细胞碎裂或消失，淋巴滤泡区出现少量多核巨细胞和酸性粒细胞浸润(图1I)。

2.2.6　扁桃体　局灶性淋巴细胞坏死，淋巴滤泡区出现少量多核巨细胞。

图1　PDNS的组织病理学变化

Fig.1　Thehistopathologic changes of porcine dermatitis andnephropathy syndrome

2.4　PCR检测结果

以各组织总DNA为模板，进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，在1 154bp位置处可见清晰条带，片断大小与阳性对照相符(图2)。

M.DNA标准DL 2 000；1.待检样品；2.阳性对照；3.阴性对照

M.DNA Marker DL 2 000；1.Sample；2.Positive control；

3.Negative control

图2　感染PCV-2猪内脏混样的PCR检测

Fig.1　PCR detection of the mixed sample inpig infected with PCV-2

3　讨论

PCV-2已呈世界性分布，对养猪业造成了严重影响。随着对PCV-2研究的不断深入，除了PMWS和PDNS之外，还有繁殖障碍-呼吸综合征、增生和坏死性肺炎、仔猪先天性震颤、增生性肠炎、渗出性表皮炎、坏死性淋巴结炎等疾病也与PCV-2感染有关。但很多学者认为，从临床症状和肉眼病变很难准确判断与其相关疾病的区别，即使用分子生物学方法检测PCV-2，也只能证实有猪圆环病毒感染，因此猪圆环病毒感染的组织病理学研究显得非常重要和必要。有关PDNS的研究国外报道较多，其诊断标准主要包括：①存在出血和坏死性皮肤病变，主要位于后肢和会阴部位，肾脏水肿、苍白，广泛的皮质淤斑；②存在系统性的坏死性脉管炎及坏死性和纤维蛋白性血管球性肾炎。本文所观察到的自然感染病例是在饲养至65kg左右时发病，病理学观察表明病毒主要侵害猪的肾脏、淋巴组织、皮下血管和肺脏，尤其是肾脏，呈现纤维蛋白性坏死性肾小球肾炎，肾实质受到不同程度的破坏，是造成体内泌尿障碍、水肿和渗出的主要原因；病毒侵害真皮和皮下组织中的血管，血管壁呈现坏死性炎症变化，血管出血，炎性细胞大量浸润，导致皮肤淤斑和表皮坏死。此外，在淋巴结中可以观察到淋巴细胞大量缺失，淋巴组织中脉管坏死性炎症，这是猪感染PCV-2的特征性病理变化之一。本病例病理学观察结果与文献报道的PDNS相符，病原学检测结果也证实该猪群感染了PCV-2。

在脾脏、淋巴结、皮下炎症区和肾脏炎症区，还可以看到大量酸性粒细胞浸润，结合以上病理学变化特点，本病的致病机理可能与Ⅲ型变态反应有关。

PDNS通常发生在保育猪和生长期的猪，在成年猪散发，流行率相对较低，不超过1%。本研究所观察到的病例是育肥期发病，感染率在2.5%左右。但PCV-2对猪免疫系统的损害相当严重，从本试验对感染猪的组织病理学观察就能够支持这一观点，其结果形成免疫抑制，增强对其他多种病原体的易感性，引起在正常情况下具有较低致病性的病原体感染发病，使猪群发生难以控制的复发性疾病和多重感染。在本研究中除了对心、肝、脾、肺等内脏器官进行了细菌培养之外，还应用PCR对猪瘟、猪伪狂犬、猪蓝耳病等进行了检测，结果均为阴性，说明该猪群未继发感染其他疾病，使我们更清晰地观察到PDNS的病理学变化。

近年来，世界上还没有一种有效的可用于该病防治的疫苗，有关PCV-2疫苗的研制，遇到的主要问题有毒株在体外培养繁殖能力差，获得的病毒滴度低，疫苗免疫效力评价困难，导致疫苗研究的难度增大。本文仅对该猪群进行了对症治疗，通过注射黄芪多糖和地塞米松，恩诺沙星拌料，维生素B2和维生素C饮水，发病猪群很快恢复了健康。