摘 要：根据GenBank?上发表的牛呼吸道合胞体病毒核衣壳蛋白N基因序列，设计合成了一对特异性引物，扩增大小为596bp的目的片段，通过特异性试验、敏感性试验和重复性试验建立了牛呼吸道合胞体病毒的RT-PCR检测方法。所建立的牛呼吸道合胞体病毒的RT-PCR方法与牛腺病毒、牛副流感病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛无浆体均无交叉反应，该方法的敏感性可达1TCID50。结果表明，该方法具有快速、敏感、特异性强和重复性好等特点，可作为牛呼吸道合胞体病毒检测的一种方法。
关键词：牛呼吸道合胞体病毒；反转录-聚合酶链反应；检测
牛呼吸道合胞体病是由牛呼吸道合胞体病毒(Bovine respiratory syncytialvirus，BRSV)引起的一种急性、热性传染病。BRSV属于副黏病毒科肺病毒属，为单链负股RNA病毒，是引起牛和其他反刍动物急性呼吸道疾病的主要病毒之一。该病以发热、流泪、流鼻液、流涎、呼吸急迫、咳嗽、乳牛泌乳量显著下降等为主要特征。牛呼吸道合胞体病对养牛业危害很大，15月龄～18月龄牛发病率高达80%～100%，死亡率为1%～3%，给养牛业造成很大的经济损失。在欧盟许多国家该病被列为仅次于牛病毒性腹泻(BVD)及牛传染性鼻气管炎(IBR)的三大重要牛病之一。
近年来，国外学者对BRSV蛋白组成和基因组结构进行了较为深入的研究，研究多集中在融合蛋白(fusionprotein，F)、黏附蛋白(attachmentprotein，G)和核衣壳蛋白(nucleoprotein，N)。研究结果表明，N蛋白基因具有高度保守性，不同BRSV分离株之间的核苷酸和氨基酸的变异率分别为1.5%和0.7%，并且在BRSV感染细胞中N蛋白含量最高。因此，本研究以BRSV标准株N蛋白基因为研究对象，建立了BRSV的RT-PCR检测方法，希望能用于牛呼吸道合胞体病的临床诊断。
1 材料与方法
1.1 病毒株和细胞
牛呼吸道合胞体病毒(BRSV NMK-7株)、牛腺病毒7型(BAdV-7 Fukuroi株)和牛副流感病毒3型(BPIV-3BN-1株)由日本动物卫生研究所惠赠；牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV DQ分离株)、牛无浆体(AnaplasmamarginaleHQ株)由黑龙江八一农垦大学传染病实验室分离鉴定和保存。非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)购自中国科学院上海细胞库。
将BRSV NMK-7标准毒株接种于长成单层的Vero细胞上，当细胞发生明显的细胞融合病变时收获病毒液，反复冻融3次，经4 000r/min离心15 min，吸取上清作为病毒液，测定效价后置－70 ℃保存备用。
1.2 试剂与主要仪器
Trizol Reagent购自Invitrogen公司，M-MuLV反转录酶(200 U/μL)、HPR I RNA酶抑制剂(40U/μL)、dNTP(10 mmol/L)、DEPC水、BioReady LATaqDNA聚合酶(5 U/μL)、dNTP (2.5 mmol/L)、DNA Marker DL 2000均购自宝生物工程(大连)有限公司；PCR仪购于美国Bio-Rad公司。
1.3 引物的设计与合成
根据GenBank?上发表的BRSV N蛋白基因序列，DNA Star比对所有BRSVN蛋白基因序列，利用Oligo6.0在保守区设计两条引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。N基因的上游引物为：5′-TATGCTATGTCCCGATTGG-3′，下游引物为：5′-ACTGATTTGGCTAGTACACCC-3′，预计扩增产物为596bp。
1.4 病毒核酸的制备
1.4.1 BRSV、BPIV的RNA提取 按照TrizolReagent试剂说明书提取总RNA。主要步骤为①取接种病毒细胞1瓶，反复冻融3次，4 000 r/min离心15min，吸出上清；②取200 μL上清液后加入600 μL Trizol，振荡30 s，静置5 min，加入冷的氯仿200μL，混匀后静置10 min，在4 ℃以12 000 r/min离心15min；③取出上清转移至一个新的离心管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀，于－20 ℃沉淀1 h，在4 ℃以12 000r/min离心10 min，其沉淀经真空干燥后溶于20 μL DEPC-H2O中。
1.4.2 BAdV-7、IBRV的DNA提取 采用SDS-蛋白酶K法提取阳性细胞毒基因组DNA。500μL病毒细胞上清，加入等量的消化缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl、20 mmol/LEDTA、10 mL/L SDS)58 ℃保温1 h，然后加入蛋白酶K(终浓度为200 μL/mL),37 ℃消化2h。酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)各抽提一次，上清加入两倍体积的无水乙醇和1/10体积的3 mol/L的NaAc(pH5.2)，－20 ℃放置2 h,13 000r/min离心15 min，弃上清，用700 mL/L乙醇洗涤沉淀，真空干燥后，用20μL灭菌水溶解DNA沉淀，置－20 ℃保存备用。
1.4.3 A.margina的DNA提取 参照McLaughlin G L等报道的方法提取A.marginale基因组DNA。
1.5 RT-PCR反应
1.5.1 反转录 20 μL反转录(RT)体系中，反转录引物(上游)1 μL，模板11μL,70 ℃作用5 min，冰浴2min；再加入5×M-MuLV buffer 4.0 μL，10 mmol/L dNTP 2.0 μL，HPR IRNA酶抑制剂1.0 μL,37 ℃作用5 min；离心后加入M-MuLV反转录酶1.0 μL，充分混匀后离心，42 ℃温浴90min,70 ℃ 10 min灭活反转录酶，冰浴2 min，置－20 ℃保存备用。
1.5.2 PCR扩增体系与扩增产物的检测
PCR反应于25 μL体系中进行，LATaqbuffer 2.5 μL，dNTP(2.5 mmol/L)1.5μL，上、下游引物(20 μmol/L)各0.5 μL，模板DNA2.0 μL，ddH2O 17.8 μL，后加LATaq(5 U/μL)0.2 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；进入循环，94 ℃变性50 s，56 ℃退火50 s,72℃延伸50 s，共30个循环；最后72 ℃ 10 min。PCR产物于4 ℃保存。取反应产物5μL，加入适量的上样缓冲液，混匀后于10 g/L琼脂糖凝胶(EB浓度为5 μg/mL)中200 V电压下电泳10 min，GelDoc 2 000成像系统(美国，BioRad公司)观察并拍照。
1.6 PCR试验条件优化
1.6.1 dNTP浓度优化 在25 μL反应体系中分别加入2.5 mmol/L dNTP0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 μL，按最佳反应程序进行PCR扩增，取5 μL产物进行电泳。
1.6.2 退火温度优化 以48℃为最低温度，设置12个梯度，选择其中的8个温度(48.1、49.3、52.4、56.3、58.3、60.6、62.0、63.2℃)进行试验。以上各PCR产物均取5 μL上样电泳，溴化乙锭染色，在凝胶成像系统中观察扩增结果。
1.7 特异性试验
按照上述方法分别提取IBRV DQ分离株阳性细胞毒DNA、A.marginaleHQ株的DNA；按照Trizol法分别提取BRSV NMK-7株、BAdV-7 Fukuroi株、BPIV-3BN-1株阳性细胞毒和Vero细胞的总RNA，反转录获得cDNA，同时用灭菌水作空白对照，采用上述优化的PCR反应体系和反应条件进行特异性试验。
1.8 敏感性试验
首先采用微量法，测定BRSV标准毒NMK-7株细胞培养液的TCID50值(病毒滴度为105TCID50/0.1 mL)，然后将病毒液用PBS进行连续的10倍倍比稀释，使其病毒滴度分别为105TCID50～10－1TCID50，将各稀释度的病毒液按Trizol法分别提取总RNA，并以相同条件进行RT-PCR，确定其敏感性。
1.9 重复性试验
用建立的RT-PCR检测法，对牛呼吸道合胞体病毒(BRSV NMK-7株)、牛腺病毒7型(BAdV-7Fukuroi株)和牛副流感病毒3型(BPIV-3 BN-1株)、牛鼻气管炎病毒(IBRV DQ株)、牛无浆体(A.marginaleHQ株)、Vero细胞重复检测3次，以验证结果的可靠性。
1.10 测序
将PCR产物进行回收，克隆到pMD18-T载体上，送往上海生工生物技术服务有限公司进行测序。
2 结果
2.1 PCR条件优化
2.1.1 dNTP浓度优化 从图1可知，随着dNTP浓度的降低，产物量也在减少，为了不影响鉴定结果，建议反应体系中dNTP终浓度在0.15mmol/L(1.5 μL)以上。
M.DNA标准DL 2 000；1.0.25 mmol/L；2.0.2 mmol/L；3.0.15 mmol/L；4.0.1mmol/L；5.0.05 mmol/L；6.0.025 mmol/L
M.DNA MarkerDL 2 000；1.0.25 mmol/L；2.0.2 mmol/L；3.0.15 mmol/L；4.0.1mmol/L；5. 0.05 mmol/L；6.0.025 mmol/L
图1 dNTP浓度试验
Fig.1 The experiment of dNTP densities
2.1.2 退火温度优化 最佳退火温度56.3 ℃(图2)。
M.DNA标准DL 2 000；1.48.1 ℃；2.49.3 ℃；3.52.4 ℃；4.56.3 ℃；5.58.3 ℃；6.60.6℃；7.62.0 ℃；8.63.2 ℃M.DNA MarkerDL 2 000；1.48.1 ℃；2.49.3 ℃；3.52.4℃；4.56.3 ℃；5.58.3 ℃；6.60.6 ℃；7. 62.0 ℃；8.63.2 ℃
图2 退火温度确定
Fig.2 Determinationof anneal temperature
2.2 特异性试验
采用上述引物对几种常见的能引起牛呼吸道疾病的病原进行RT-PCR扩增。结果只有BRSV NMK-7株扩增出一条长596bp的特异性目的基因片段，而BAdV-7 Fukuroi株、BPIV-3 BN-1株、IBRV DQ分离株、A.marginaleHQ株、阴性对照(Vero细胞)及空白对照均未扩增出任何片段，说明该方法中BRSV与参考病原无交叉反应(图3)。
M.DNA标准DL 2000；1～6.分别为牛呼吸道合胞病毒NMK-7株、牛腺病毒7型Fukuroi株、牛副流感病毒3型BN-1株、牛鼻气管炎病毒DQ分离株、牛无浆体HQ株、Vero正常细胞；7.空白对照
M.DNA Marker DL 2 000；1-6.present BRSV NMK-7，BAdV-7 Fukuroi，BPIV-3BN-1，IBRV DQ，A.marginaleHQ，Vero normal cell，respectively；7.Blank control
图3 特异性试验结果
Fig.3 The results of specificity assay
2.3 敏感性试验
扩增结果显示，该方法检测的敏感度可达1 TCID50(图4)。
M.DNA标准DL 2 000；1.105TCID50；2.104TCID50；3.103TCID50；4.102TCID50；5.10 TCID50；6.1 TCID50；
7.10－1TCID50
M.DNA Marker DL 2 000；1.105TCID50；2.104TCID50；3.103TCID50；4：102TCID50；5.10 TCID50；6. 1 TCID50；7.10－1TCID50
图4 敏感性试验结果
Fig.4 The results of sensitivity assay
2.4 重复性试验
经过3次重复操作，结果一致，证明所建立的方法具有较好的重复性。
2.5 测序
通过GenBank中的Blast程序，将测序结果与GenBank?上的BRSV的N基因序列进行比对，克隆的N基因与GenBank?(AF295543、AF092942、AF188550)中N基因序列同源性为99%，说明已成功构建了pMD18-T-N重组体。
3 讨论
近年来，黑龙江省牛呼吸道传染病逐年攀升，引起牛呼吸道疾病的常见病毒有牛呼吸道合胞体病毒、牛腺病毒、牛副流感病毒和牛传染性鼻气管炎病毒，并且牛无浆体也能引起牛呼吸道疾病，从临床症状上很难区分是哪种病原感染造成的，并且可能存在多种病原的混合感染。本研究所建立的BRSV的RT-PCR诊断方法，可以区分副黏病毒科中临床症状和传播途径相同的BRSV和BPIV，为牛呼吸道疾病的鉴别诊断奠定了基础。
特异性试验结果表明，本研究所建立的牛呼吸道合胞体病毒RT-PCR方法与牛腺病毒、牛副流感病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛无浆体没有出现交叉反应，其检测结果均为阴性。并且所扩增片段序列与GenBank?(AF295543、AF092942、AF188550)中N基因序列同源性为99%，进一步证实了该方法具有良好的特异性。
在敏感性试验中，有研究者采用测量cDNA浓度来测定RT-PCR方法的灵敏度，该方法忽略了病毒的RNA提取、反转录过程对试验结果的影响，不足以代表RT-PCR整个反应过程。本研究采用稀释阳性细胞毒的方法，可以检出1TCID50阳性细胞毒中的病毒核酸，这与Larsen等的结果相接近，表明本方法具有较高的敏感性。在相同条件重复3次，都得到了相同的结果，表明该方法比较稳定可靠。
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