动物乳腺生物反应器在现代生物制药中的应用

目的基因在乳腺中表达的转基因动物称为动物乳腺生物反应器(mammaryglandbioreactor)，又称为动物个体乳腺表达系统。动物乳腺生物反应器出现于20世纪90年代初，它是一项利用转基因动物的乳房代替生物发酵，大规模生产供人类疾病治疗和保健用的生物活性物质或药用珍稀蛋白的现代生物技术，其核心内容是利用乳蛋白基因的乳腺特异性调控成分驱动外源基因在动物乳腺中高效表达，以期通过源源不断地回收乳汁来提取大量有重要药用价值的生物活性外源蛋白。因此，动物乳腺生物反应器在现代生物制药领域中具有广阔的开发前景。

1、动物乳腺生物反应器的原理

动物乳腺生物反应器的原理是应用重组DNA技术和转基因技术等，先将外源基因置于乳腺特异性调控序列之下，再将该基因转移到尚处于原核阶段或1～2细胞的受精卵的动物胚胎中，经胚胎移植得到转基因乳腺表达的动物个体，通过回收乳汁获得表达产物。用转基因动物生产药用蛋白的基本过程提高外源基因表达量的关键在于乳腺生物反应器表达载体的构建。外源基因在乳腺组织中特异性表达需要乳蛋白基因的一个启动子和调控区，即引导泌乳期乳蛋白基因表达的序列。目前，用于转基因动物乳腺生物反应器的调控元件主要有B一乳球蛋白基因(BLG)调控序列、B一酪蛋白基因调控序列、乳清酸蛋白基因(WAP)调控序列和乳清白蛋白基因调控序列，这些乳腺组织特异性表达的调控元件可以跨越种属界限。转基因技术是制备乳腺生物反应器的核心技术。目前，制备乳腺生物反应器的转基因方法除了原核显微注射法外，还有逆转录病毒介导法、精子介导法、胚胎干细胞(ES)介导法、基因打靶、体细胞克隆等。各种转基因方法均有其独特的优点和各自的局限性，但原核显微注射法仍是主要的动物转基因方法。

2、动物乳腺生物反应器在现代生物制药中的应用研究

随着转基因动物的问世，通过转基因动物进行药用蛋白生产已成为现实。大量资料表明，外源药用蛋白在转基因动物体内最理想的表达场所是乳腺组织。GordonK等人建立了第一例乳腺生物反应器小鼠模型，并利用组织型纤溶酶原激活剂(tPA)与小鼠乳清酸蛋白(WAP)基因的启动子构建了重组基因，成功地培育出了37只在乳汁中能表达tPA的转基因小鼠，此研究结果显示用动物乳腺生物反应器生产高附加值药用蛋白的可能性。此后，将乳腺生物反应器作为药用蛋白的全新生产模式成为研究的热点，大量编码人类蛋白基因。目前，国外已在动物乳腺生物反应器的研究和开发方面投入了大量资金，使该项技术得到了改进和提高；全世界有二三十家公司致力于开发动物乳腺生物反应器重组蛋白药物，表达水平达到可以进行商业生产的药用蛋白有近30种，其中正在进行临床试验的蛋白有l0余种，另外还有上百种重组蛋白正处在研发阶段。

特别值得一提的是，2006年6月份由全球最著名的动物乳腺生物反应器研发企韭美国GTC研制成功的世界上第1个利用转基因动物乳腺生物反应器生产的基因工程蛋白药物——重组人抗凝血酶Ⅲ(商品名为ATryn)的上市许可申请获得了欧洲医药评价署人用医药产品委员会肯定的批准意见。据估计该药的全球潜在市场每年高达1．5亿美元。20世纪80年代初，我国就已经开始了转基因动物和动物乳腺生物反应器的研究，国家对该领域的研究也给予了大力支持。1983年，中国科学院的施履吉院士首次在国内提出了乳腺生物反应器的构想，并成功获得了表达乙肝病毒表面抗原的转基因兔，为我国通过转基因动物的途径获得珍贵药材打下了基础。1998年，国家在“863”计划中将“动物乳腺生物反应器研究”列为重大专项，加强了研究和开发的力度。目前，我国在动物乳腺生物反应器制药技术研究领域中已先后获得了转基因鼠、转基因绵羊、转基因山羊、转基因猪和转基因牛等，并且还获得了一批高效表达重组蛋白的转基因动物乳腺生物反应器。如2005年，在科技部“863”计划生物反应器重大专项的资助下，中国农业大学李宁教授领导的“高效表达人乳铁蛋白等药用保健蛋白的奶牛乳腺生物反应器”课题组与北京济普霖生物技术有限公司合作，经过4年的努力，首次在国际上利用体细胞克隆技术获得人乳铁蛋白转基因克隆牛和人仅一乳清白蛋白转基因克隆牛，其中人乳铁蛋白转基因克隆牛表达量达到3．4g／L，为世界上重组人乳铁蛋白在奶牛乳腺中最好的表达水平(3．0g／L)，而人仅一乳清白蛋白转基因克隆牛也获得1．5g／L的表达，接近国际最好水平，并且具有与天然蛋白相同的生物活性。

3、动物乳腺生物反应器在现代生物制药中应用的优势

3．1产品产量高，易收获

动物乳腺是一种高度分化的专门化腺体，也是天然的高效合成蛋白质的生物反应器，有强大的合成蛋白质的能力，尤其是一些经过遗传改良的优良乳用品种。一头奶牛一年可产奶8000～10000L，而一只绵羊和山羊可产奶800～1000L，以最低表达量为1L的重组蛋白计算，一头奶牛一年就可生产8～10kg重组蛋白，年产量相当可观。

3．2产品活性高，无污染

动物乳腺作为一个完善的“分子农场”可对重组蛋白进行翻译加工，包括糖基化、磷酸化、羧基化和分子组装等。用动物乳腺生物反应器生产的药品，生物活性好，非常接近天然产品；并且用乳汁生产药用蛋白的过程也不会产生工业废料，不会对环境造成污染，乳腺生物反应器的产品属于纯生物制品，质量安全可靠，无污染。

3．3产品成本低，周期短

一头转基因动物相当于一个制药车间，作为乳腺生物反应器的转基因动物如牛、羊为草食性动物，产奶量高，饲养成本低，可通过繁殖扩大数量，进行工厂化生产，并且从乳中提纯产品的操作比较简单。有资料表明，用传统的细胞培养来生产1g基因药物，平均成本为100～1000美元，而利用转基因动物乳腺反应器来生产则只需10～25美元。此外，从药物生产开发周期方面来看，目前一种新药从研制开发、通过新药审批，直到上市需要15～20年。如果禾0用转基因动物乳腺生物反应器进行研制开发，新药上市约5年。如以动物生命的周期计算，转基因羊从显微注射到泌乳的周期是18个月，而转基因牛也只需要25～29个月。

3．4外源基因可以遗传，产品经济利润丰厚

动物乳腺表达的外源基因可以遗传给后代，因此一旦获得一个能生产某种有价值蛋白质的动物个体，就可以通过人工授精、胚胎分割及克隆等方式扩大有商业价值个体的数量，大量生产转基因动物后代，并可继续从其阳性后代获取巨额经济利润。如荷兰Pharming公司用转基因牛生产乳铁蛋白，预计每年生产的含乳铁蛋白奶粉的价值是50亿美元。

4、在动物乳腺生物反应器的技术研究中存在的主要问题目前，在动物乳腺生物反应器的技术研究中尚存在一些难题¨2]：(1)生产转基因动物的成功率低；(2)目的蛋白的表达水平远低于乳汁中总蛋白含量；(3)目的基因的分离、改造、载体构建、体细胞克隆等技术环节还不够成熟；(4)“位置效应”与“剂量效应”目前无法克服；(5)乳汁蛋白基因表达调控的机理、目的基因在宿主染色体上整合的详细机制、基因表达调控元件在不同家畜中表现差异的原因、乳腺细胞对蛋白质加工修饰的机理等还未弄清；(6)产品安全性的问题，外源基因侵入对动物及基因药物对人体正常功能有何影响，是否会造成基因污染，尚难定论。这些难题的解决有待于今后在动物乳腺生物反应器理论研究上的突破及其技术路线的进一步完善。

5、展望

动物乳腺生物反应器开创了现代生物制药产业的新途径，已成为生物反应器技术中最活跃、最具有商业化发展前景的研究领域之一。1997年，美国红十字会和遗传学会预测，到2010年，在所有基因工程药物中，利用转基因动物乳腺生物反应器生产的份额将高达95％。动物乳腺生物反应器虽然还有许多问题有待于进一步研究和探索，但它仍然是生产珍稀药

用蛋白的理想工具，在现代生物制药技术上具有无与伦比的优势，将成为现代生物制药领域的革新方向，并具有巨大的经济价值和广阔的开发应用前景。