抗内毒素治疗研究现状

1限制内毒素生成?
1.1 减少内毒素的释放?
清除病原菌是治疗感染性休克的关键，使用有效抗生素能清除或抑制细菌繁殖，实际上也就减少了内毒素释放。但自1977年Hopkin首次发表抗生素可以诱导内毒素释放的观点以来，这一现象越来越引起广大临床工作者的注意。体外研究发现，在用有效抗菌药物处理的培养基中，细菌计数降低，但同时伴有内毒素总量或游离内毒素水平的升高。实验性菌血症动物抗菌药物治疗后血中内毒素水平高于未治疗者，且内毒素释放增加与细菌计数降低相关。国内周向东等研究了不同杀菌性抗菌药杀菌过程中致细菌内毒素释放的特点，发现各种抗菌药依据其致内毒素释放能力大小可分为高、中、低三群：β-内酰胺类抗菌药物内部各品种之间差别显著，氨曲喃、头孢他啶、头孢唑啉、头孢呋辛、氨苄西林属高释放品种，阿莫西林/克拉维酸、亚胺培南属低释放品种，氨基糖甙类各品种均属于中等释放品种，喹诺酮类的环丙沙星属高释放品种，氧氟沙星属中等释放品种，而多黏菌素B则属低释放品种。因此，治疗GNB感染，在杀菌效能及其他情况（如药物浓度及作用时间）相同时，选用诱导内毒素释放少的抗菌药值得广大医务工作者注意，同时开发新一代高效杀菌、低毒的抗菌药物有较大的实用价值。?
1.2 抑制内毒素的合成?
细菌类脂A是内毒素的最主要毒性成分。有研究表明，通过对大肠杆菌类脂A乙酰葡糖胺转酰酶编码基因的诱变，细菌活性及类脂A合成下降10倍以上。亦有研究证实，细菌类脂A的生物合成需要酶的参与，包括乙酰葡糖胺转酰酶、乙酰葡糖胺脱酰酶、葡糖胺转酰酶以及CMP-KDO(2-酮基-3脱氧-D-甘露辛酮糖酸)合成酶等。如乙酰葡糖胺脱酰酶抑制剂L-573655和L-161240能竞争抑制细菌80%-90%的LPS合成，并在4小时内即可快速杀灭细菌。体外实验还表明经CMP-KDO合成酶抑制剂处理后，细菌的通透性明显增加，对抗生素的敏感性上升10%。?
2 抗内毒素特异性抗体?
内毒素侵入体内后，首先与血浆中的内毒素结合蛋白（LBP）结合，再与单核细胞、巨噬细胞等髓源性细胞表面的脂多糖受体CD14（mCD14）或血浆中的可溶性受体CD14（sCD14）结合，激活单核细胞、巨噬细胞等释放一系列高生物活性的细胞因子，引起组织损伤及休克的发生。随着分子免疫学的发展及对内毒素休克发病机理的深入研究，相继出现了许多针对发病过程各阶段的抗体阻断治疗。?
2.1 抗核心糖脂抗体?
2.1.1 多克隆抗体 早期人们用加热灭活的大肠杆菌J?5免疫兔，产生抗内毒素多克隆抗血清，分别用于拮抗大肠杆菌、绿脓杆菌的攻击，结果动物的存活率远高于对照组。后来人们又用大肠杆菌J?5株免疫健康志愿者，将获得的免疫血清预防性地给予腹部大手术后病人，结果发现他们感染性休克的发病率显著下降。但是，由于志愿者机体无再次应答能力，而且抗体滴度又无法控制，所以此类抗体没能在临床推广。?
2.1.2 单克隆抗体 抗核心糖脂的单克隆抗体有两种：一种是鼠源性的IgM单抗E-5，是由煮沸J?5疫苗免疫获得；另一种是人源性IgM单克隆抗HA-1A，也由加热灭活的J?5疫苗产生。E?5和HA-1A曾一度在部分西方国家被推荐使用，但由于治疗效果的不一致及其费用昂贵使人们有必要对其疗效及安全性做进一步的观察和评价。?
2.2 抗CD14/LBP的抗体?
2.2.1 抗CD14的抗体CD14是LPS的受体，以sCD14和mCD14两种形式存在。sCD14控制内皮和上皮细胞对LPS的应答，mCD14在单核细胞、巨噬细胞应答LPS中起重要作用。Triantafilou等研究发现LPS在100 ng/ml以内对内皮细胞的结合依赖CD14/LBP，抗CD14的单抗可阻断这种结合，但超过该剂量则不依赖CD14/LBP。目前普遍认为LPS是多种分子的多聚体，而CD14只是其中配基结合亚单位，当LPS超过一定剂量时，可通过其它亚单位来传递LPS的信号刺激而发挥作用。?
2.2.2 抗LBP的抗体 LBP是肝脏合成的一种急性期血清蛋白，LPS在体内的作用依赖于LBP的存在。1986年Tobias首次从兔急性反应血清中分离、纯化出LBP，并证明LPS通过类脂A与LBP结合形成LPS-LBP复合物，与CD14结合激发细胞应答。Schutt通过实验发现LBP在GNB感染的生理及病理生理学中起着重要作用。动物实验证实预防性给予抗LBP抗体能保护小剂量内毒素的损害，但不能改善大剂量内毒素造成的损伤，同样说明LPS在大剂量时通过非依赖LBP途径刺激细胞应答。关于LBP抗体的保护作用，目前尚处于探索阶段。?
2.3抗CD11/18抗体?
CD11/18复合体是一种粘附分子，是调节中性粒细胞粘附到内皮细胞的细胞表面受体，也是中性粒细胞进入炎症部位的第一步。抗CD11/18抗体抑制了中性粒细胞的粘附及向血管外迁移，说明抗CD11/18抗体在早期应用时有一定的保护作用。Gardinali等在兔腹膜炎模型中预先给予抗CD11/18抗体的家兔死亡率要比对照组低40%，但此疗效并不持久。目前，关于CD11/18的抗体治疗正在进一步研究中。?
2.4 鸡卵黄抗体?
用特定的抗原免疫产蛋母鸡后，其蛋黄中富含大量的IgY，而该抗体又来源于同一个体，在抗体的均一性上类似于单克隆抗体。IgY对酸、酶、温度具有较高的稳定性，为口服应用提供了可能。国外学者用IgY在抗轮状病毒腹泻及抗白色念珠菌感染治疗方面取得了满意疗效。用大肠杆菌J?5株作抗原免疫鸡制备抗内毒素的特异性IgY，通过口服直接从肠道拮抗内毒素有可能成为治疗内毒素休克的新途径。?
3 内毒素拮抗剂?
3.1 类脂A结构类似物?
Loppnow等研究发现，类脂A的生物合成前体物质及无毒类脂A均能与内毒素竞争结合LBP，从而抑制了巨噬细胞、嗜中性粒细胞活性。类脂X是大肠杆菌类脂A的单糖前体分子，也是第一个证实对内毒素有拮抗作用的分子。此后以类脂X为先导化合物进行结构修饰，得到一系列类似物，但总的看来其拮抗作用相对较低，效果也有限，不过大肠杆菌双糖前体分子类脂IV?A对内毒素的拮抗作用更强。E5531是以荚膜细菌类脂A为先导化合物，经结构修饰得到的类似物，其作用机理是通过阻断内毒素与细胞相互作用进而抑制内毒素引起的细胞活性，可抑制TNF、IL-1、IL-6、IL-8、IL-10及NO等的释放，同时E5531及E5531-LBP复合物能竞争性抑制LPS与CD14受体结合。E5531的抗内毒素活性比类脂X大大增强，现已进入Ⅱ期临床实验阶段，用于内毒素引起的发热和感染性休克的治疗。?
3.2 抗内毒素蛋白及多肽类?
抗内毒素蛋白及多肽具有杀菌、中和内毒素、抑制免疫细胞活性的作用。杀菌性/通透性增加蛋白（BPI）是多形核白细胞（PMN）的嗜天青颗粒中带正电荷的蛋白质，由456个氨基酸组成，在PMN吞噬过程中释放到吞噬泡内。BPI与内毒素有高度亲和性，能中和内毒素活性，增加细菌壁的通透性，并杀死细菌，而且瑞典Lund大学最近的一项研究表明BPI能抑制LPS诱导诱生型一氧化氮（iNO）的合成，减少NO含量，恢复血管对收缩剂的反应，预防ETM。目前研制出的人重组BPI-21?和BPI-23已被美国FDA批准进入Ⅲ期临床实验。作为一种"超级抗生素"，BPI被认为是一种存在巨大潜力的抗内毒素和GNB感染的药物，已成为研究热点。鲎抗LPS因子（LALF）是从美洲鲎中提取得到的单链多肽，体外能抑制LPS诱导人内皮细胞和鼠脾细胞的生物活性。晶体学研究发现，LALF分子中存在的β折叠反平行结构可能就是LPS的结合位点。根据BPI和LALF中LPS的结合部位以合成结构与功能和该部位相似的多肽物质是当前的研究重点。BG38就是根据BPI中82-108位氨基酸（与内毒素结合部位）片段合成的分子多肽。将BG38与钥孔嘁血蓝蛋白（KLH）载体连接，可稳定GB38结构，增强BG38对LPS的亲和力，同时克服了BG38体内生物半衰期短的缺点。在小鼠ETM模型中，BG38-KLH（350μg）几乎完全中和了血浆中内毒素（10μg），TNF-α水平也明显低于内毒素组。BU3是在合成BPI中LPS结合部位的基础上，通过分子杂交技术融合IL-8中β折叠结构，得到的含33个氨基酸序列的小分子多肽，其空间结构更近似于BPI和LALE中的LPS连接部位，因而BU3体内、体外抗内毒素活性明显强于BG38-KLH，但BU3体内中和内毒素，抑制TNF-α分泌的能力不及BPI。?
3.3 多阳离子结构拮抗剂?
内毒素分子含有大量磷酸基，带负电荷，而维持这种负电荷的存在可能就是内毒素发挥生物活性的必要条件之一。Dand等对在内毒素拮抗剂的研究中发现，带有正电荷基团的药物就是通过其正电荷基团与内毒素类脂A上的PO4-结合，从而破坏了内毒素的结构而起到拮抗效果。国内外学者对多阳离子结构拮抗剂作了大量研究。阳离子抗菌肽的研究方面：多黏菌素B（PMB）为一种多价阳离子环肽抗生素，可直接与携带阴离子的类脂A部分特异性结合而使其失去活性，同时作为一种蛋白激酶C抑制剂,PMB能改善内毒素诱导胰岛素分泌过多的状况，但由于该药物抗菌谱窄，且对神经系统和肾脏均有毒副作用而限制了它的使用，而多黏菌素B九肽是采用酶裂解多黏菌素B而得到的，与前者相比，九肽衍生物具有毒性低，且保留抗内毒素活性的特点，很有希望使用于临床。颜亮等研究发现钌红可拮抗内毒素多种生物学活性，其主要机理就是钌红的多阳离子氨基与内毒素结合，一方面破坏了其正常结构，另一方面可中和其负电荷。陆大祥等自1996年以来对用甘氨酸拮抗内毒素作了连续报道，他们认为甘氨酸是人体固有的氨基酸，为两性电解质，在一定的溶液中可因氨基酸末端游离形成的阳离子与类脂A结合，形成复合物干扰内毒素结构而使其灭活，并有可能成为一种具有实用价值的内毒素拮抗剂。?
4 炎性介质拮抗剂?
对内毒素致病机理的研究表明，内毒素诱发的炎性细胞因子对组织细胞的损害远远超过内毒素本身对机体的直接影响。细胞因子是由内毒素与单核细胞、巨噬细胞的表面受体结合，通过信号转导、基因激活、mRNA转录，翻译成蛋白质，前体蛋白质成熟完成细胞因子的分泌。过量的细胞因子形成瀑布样连锁反应，引起脓毒血症、休克或死亡，其中以TNF-α、IL-1等最为严重。?
目前常用的抗炎性介质抗体有：抗细胞因子抗体（抗TNF单抗、抗IL-6单抗、抗IFN-γ单抗等）、抗细胞因子受体抗体（抗TNF受体抗体、抗IL-6受体单抗等）和其受体拮抗剂（可溶性TNF受体拮抗剂、IL-1受体拮抗剂等）及类似物以及各种抗细胞因子和类脂介质的药物（己酮可可碱、羟乙磺酸戊烷脒、糖皮质激素、腺苷类药物等）。应该说几乎每一种细胞因子拮抗剂的临床实验都有一定疗效，但总体情况难以令人满意。因为一方面细胞因子网络是一个相互作用、错综复杂的系统，从一个或少数几个环节进行干预，很难取得明显效果；另一方面这些炎症介质的产生是机体对内毒素防御反应的一部分，具有复杂的生理功能，可调节机体免疫能力，当其被阻断，减轻组织损伤的同时，机体的免疫力也被消弱；此外还可能存在其它未知的炎性介质。新近的研究显示高迁移率族蛋白-1（HMG-1）可能就是LPS致病过程中致死性的远期介质之一，Wang等用LPS攻击大鼠，8～32小时后大鼠血中HMG-1水平升高，给予抗HMG-1抗体，可减轻LPS对大鼠的致死性，而HMG-1本身对大鼠也有致死性。HMG-1作为内毒素休克病理过程中的远期介质，其致病机理及对其进行干预措施正在受到人们的重视。?
NO是体内一种重要的调节生命活动不可缺少的信息小分子，促进细胞因子释放，可造成血压下降，心肌抑制，引发休克。体内NO是由NO合成酶（NOS）催化L-精氨酸末端胍基氮氧化而成。在LPS刺激下，内皮细胞和血管平滑肌细胞内的诱生型NO合成酶（iNOS）活化，产生大量NO。研究发现除了iNOS基因的小鼠对LPS导致的脓毒血症抵抗力显著增强，而且应用iNOS抑制剂可提高内毒素休克动物的生存率。但也发现iNOS抑制剂过量可使动物病死率升高。目前认为，NO在内毒素休克中具有损害与保护双重作用，无选择性或过度抑制NO均可加重机体器官损害。?
5 其它药物?
血浆中脂蛋白可以介导内毒素的清除和脱毒，内毒素类脂A插入脂蛋白的磷脂双层中形成脂蛋白-内毒素复合物，抑制了LPS的活性；同时该复合物代谢由脂蛋白介导，加速血浆内毒素的消除，增加肝脏吞噬内毒素的量，提高胆汁内毒素的分泌，减少了体内、外巨噬细胞TNF的释放。有研究表明,脂蛋白-内毒素的相互作用主要集中在高密度脂蛋白（HDL）。已有学者研制出重组HDL（rHDL）来补充体内HDL的缺乏，以期加速内毒素在血液循环中的清除。目前对rHDL的研究已进入Ⅱ期临床实验。此外，中医药工作者在拮抗内毒素及阻断或减弱其介导组织损伤方面做了大量工作。研究表明：单味药黄芪、人参、丹参、川芎、青蒿素、穿心莲、蒲公英、板蓝根等可促使内毒素灭活或降低其活性；中药成分山莨菪碱可降低被内毒素激活的白细胞与内皮细胞间的粘附力，减少白细胞释放生物活性物质而改善休克时的微循环障碍；大承气汤和承气合剂、黄连解毒汤等中药复方对家兔ETM模型亦有多方面的治疗作用。?
6 展望?
综上所述，从致病机理出发，目前抗内毒素治疗途径主要有两条：一是通过结合内毒素从而中和并阻断其作用，加速其灭活，同时与抗菌药物合用可增强抗GNB感染的作用；此外抑制和破坏内毒素刺激靶细胞活化的级联反应，阻断或减少炎性细胞因子的产生。但遗憾的是国内外尚无一种疗效明显、毒副反应低、价格低廉的抗内毒素感染的理想药物。因此，尽快研制亲和力高、中和能力强、毒性低的抗内毒素新药对及早降低内毒素感染率及死亡率具有重要意义。?
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