口蹄疫病毒非结构蛋白基因的克隆表达及免疫活性的研究

摘　要：从口蹄疫病毒(FMDV)细胞培养物中提取总RNA，设计简并引物通过RT-PCR获得了完整的3ABC基因片段，将3AB基因和部分3ABC基因分别克隆到原核表达载体上构建重组表达质粒pET-3AB和pET-3ABC，然后转化BL21(DE3)plysS进行诱导表达，将表达产物进行SDS-PAGE分析和Westernblot鉴定。结果表明，3AB基因和3ABC基因可以在大肠埃希菌中高效表达，且表达产物能够与FMDV阳性血清产生免疫反应。进一步摸索重组蛋白的纯化条件，制备纯化蛋白，以纯化的表达产物为包被抗原进行间接ELISA检测，结果表明，重组蛋白具有特异的免疫学活性，能够用于鉴别FMDV感染动物血清和免疫动物血清。

关键词：口蹄疫病毒；非结构蛋白；3AB基因；3ABC基因；原核表达；间接ELISA

口蹄疫(Foot-and-mouthdisease，FMD)是一种偶蹄动物的烈性传染病，可引起大范围的易感动物发病，被世界动物卫生组织(OIE)列为必须报告的动物疫病。该病传染性极强，一旦暴发，必须对感染动物和怀疑处于潜伏期的同群动物进行紧急处理，同时封锁疫点周围的地区，禁止动物移动和畜产品调运上市，从而导致该地区甚至该国家的畜产品进出口贸易停滞。历史上口蹄疫的暴发给世界畜牧业生产造成巨大的经济损失，也严重地影响了社会政治、经济的稳定发展，是“世界政治经济病”，因此，口蹄疫的防控工作始终得到世界各国政府的高度重视。但是，FMDV的抗原结构复杂，并且存在抗原变异。有些免疫动物在接触新的变异亚型毒株后，也可形成隐性感染而持续带毒。无论是在有免疫压力或没有免疫压力的情况下，病毒均可适应机体而持续存在，因此难以对FMD进行有效的防控和净化。目前，世界各国都制定了相应的政策来控制FMD，但是如何区分自然感染动物和免疫动物，一直是口蹄疫防控技术研究的重要课题。

动物自然感染FMDV后，体内产生相应的非结构蛋白抗体，而接种灭活疫苗的动物所产生的主要是针对结构蛋白的抗体。根据这种抗体差异性，许多学者对口蹄疫病毒非结构蛋白做了大量研究工作，期望通过检测非结构蛋白的抗体来区分免疫动物与自然感染动物，特别是持续感染动物。近些年来，国内外学者针对FMDV的非结构蛋白2C、3A、3B、3ABC等基因，建立了不同非结构蛋白的酶联免疫吸附试验(ELISA)，适用于鉴别诊断自然感染动物和免疫动物。目前，国内外已有很多实验室建立了检测FMDV非结构蛋白相关抗体的方法。在我国，政府对口蹄疫的防控投入了大量的人力和物力，但是目前还没有开发出商品化的鉴别诊断试剂盒。本研究应用分子生物学技术，克隆了FMDV-3ABC基因，并将3AB和3ABC基因在大肠埃希菌中进行了高效表达。Westernblot分析表明，表达产物具有良好的反应原性，能够作为ELISA包被抗原检测FMDV非结构蛋白抗体，为研制开发口蹄疫鉴别诊断试剂盒奠定了基础。

1　材料与方法

1.1　病毒、菌株与载体

亚洲1型口蹄疫病毒株和FMDV疫苗免疫动物血清、DH5α和BL21(DE3)plysS感受态细胞、原核表达载体pET30a和pET32a均由本实验室保存；pGEM-T载体购自Promega公司。

1.2　主要试剂

TaqDNA聚合酶、dNTP、AMV反转录酶、RNA酶抑制剂购自Promega公司；PCR产物回收试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司；FMDV各型阳性血清由中国农业科学院兰州兽医研究所提供；辣根过氧化物酶标记的重组蛋白G和鸡卵清蛋白(OVA)购自北京博奥森公司；His·Bind蛋白纯化试剂盒购自Novagen公司。

1.3　FMDV非结构蛋白基因的克隆及鉴定

1.3.1　引物的设计与合成　根据GenBank发表的亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒全基因及非结构蛋白基因3ABC参考序列，选择高保守区，利用Primerprimer 5.0软件设计了一对包容非结构蛋白全基因3ABC的简并引物，分别命名为N1、N2(引物序列见表1)。

1.3.2　病毒核酸提取及目的片段的扩增　使用Invitrogen公司的TrizolReagent，直接从病毒材料中提取总RNA，以N2为引物对所提RNA进行反转录合成cDNA，以所获得的cDNA为模板，用N1和N2引物进行PCR扩增。

1.3.3　PCR产物检测及序列测定　PCR产物经琼脂糖凝胶电泳进行检测，将PCR产物纯化回收后连接至pGEM-T载体，转化感受态细胞DH5α。挑取白色菌落，用碱裂解法提取质粒。选取PCR鉴定为阳性的克隆，将菌液送至上海生工生物工程技术服务有限公司测序。测序分析后将正确的重组质粒命名为pGEM-NSP。

1.4　重组表达载体的构建与鉴定

1.4.1　引物的设计与合成　根据表达载体pET30a的多克隆酶切位点，设计一对引物，用于克隆FMDV非结构蛋白的3AB基因。在上游引物添加酶切位点SalⅠ，下游引物加上酶切位点BglⅡ序列。将这对引物命名为N3和N4(引物序列见表1)。

1.4.2　部分3ABC基因的引物设计　应用DNAStar软件对FMDV完整3ABC基因进行亲水性分析和抗原位点预测，选择亲水性和抗原位点集中的一段序列作为目的表达片段，旨在通过比较，选择最为敏感特异的FMDV非结构蛋白作为诊断抗原。同上根据表达载体pET32a的多克隆酶切位点，设计一对引物，用于克隆FMDV非结构蛋白的部分3ABC基因。在上游引物添加酶切位点SalⅠ，下游引物加上酶切位点NotⅠ，将这对引物命名为N5和N6(引物序列见表1)。所有引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.4.3　PCR扩增　以pGEM-NSP为模板，用新合成的引物进行PCR扩增，分别获得相应的3AB基

因片段和部分3ABC基因片段(命名为3ABC)。

表1　FMDV-NS基因RT-PCR引物

Table 1　Primers of nonstructural gene of FMDV for RT-PCR

1.5　重组表达质粒的构建

将表达载体pET30a/32a和3AB、3ABC基因分别用SalⅠ/BglⅡ和SalⅠ/NotⅠ进行双酶切消化，纯化回收酶切产物和表达载体，将目的片段与载体用T4DNA连接酶4℃过夜进行连接，连接产物转化BL21(DE3)plysS感受态细胞，得到重组克隆菌落。挑斑培养提取质粒，双酶切和PCR鉴定为阳性的菌液测序，正确的重组质粒分别命名为pET30a-3AB和pET32a-3ABC。

1.6　重组质粒的诱导表达

分别将pET30a-3AB和pET32a-3ABC测序正确的阳性重组菌平板划线，各自挑单菌落接种5 mL含有10g/L葡萄糖的抗性LB液体培养基中，37 ℃过夜小量培养，取1 mL过夜生长饱和的菌液接种到含有10g/L葡萄糖的抗性LB液体培养基中，于37 ℃摇床培养至OD600为0.6～0.8，加入IPTG至终浓度为1 mmol/L,37 ℃诱导表达。分别于诱导后第2、3、4、5 h收集菌液1mL，进行SDS-PAGE和Western blot检测，并设未诱导的菌液作为阴性对照。

1.7　表达产物的检测、鉴定和纯化

1.7.1　表达产物的SDS-PAGE电泳　将收集的菌液以12 000 r/min离心5 min，将沉淀用适量PBS悬浮，取10μL样品加入等体积2×SDS上样缓冲液水浴煮沸5 min，未诱导的菌液同上处理作为阴性对照，用120g/L的分离胶进行SDS-PAGE检测。

1.7.2　Western blot分析　将SDS-PAGE电泳的目的蛋白条带转移到硝酸纤维素膜上，用含10 g/LOVA的PBST封闭，以FMDV阳性血清作为一抗，辣根过氧化物酶标记的重组蛋白G为二抗，用天根生化科技发展有限公司的HRP-DAB增强显色试剂盒观察。

1.7.3　重组蛋白的可溶性分析　将诱导表达的菌体收集后，于冰浴上进行超声破碎，超声时间10 s，间隔时间10 s，功率400W，超声次数40次，于4 ℃以12 000 r/min离心20 min，分别取上清和沉淀用于SDS-PAGE分析。

1.7.4　His·Bind试剂盒纯化重组蛋白　按照His·Bind蛋白纯化试剂盒的说明书对重组蛋白进行亲和层析纯化，分段收集目的蛋白洗脱液，对纯化蛋白进行SDS-PAGE分析，并测定纯化蛋白的浓度。

1.8　FMDV非结构重组蛋白间接ELISA检测方法的初步建立和免疫活性检测

用纯化的重组蛋白包被酶标板，棋盘滴定法确定重组蛋白的最佳包被浓度和被检血清稀释度，确定封闭液，二抗等ELISA工作条件，初步建立了FMDV非结构蛋白间接ELISA检测方法。同时检测FMDV标准阳性血清(A型、O型、C型和Asia1型，均由中国农业科学院兰州兽医研究所提供)和10份FMDV疫苗免疫动物血清，分析检测结果。

2　结果

2.1　RT-PCR扩增产物，重组质粒的PCR与酶切鉴定

经琼脂糖凝胶电泳检测，扩增得到两条与预期大小相符的片段3AB(672 bp)和3ABC(765bp)(图1)。经测序证明，扩增得到的目的片段为FMDV非结构蛋白基因3AB和3ABC。经PCR和酶切鉴定，重组质粒pET30a-3AB和pET32a-3ABC的基因片段与预期长度相符，电泳结果见图1。

M.DNA标准DL 2 000；1,6.完整3ABC基因扩增产物(1 311bp)；2.3AB基因扩增产物；3.重组质粒pET30a-3AB的PCR鉴定；4.重组质粒pET30a-3AB的双酶切分析；5.重组质粒pET30a-3AB；7.3ABC基因扩增产物；8.重组质粒pET32a-3ABC的PCR鉴定；9.重组质粒pET32a-3ABC的双酶切分析；10.重组质粒pET32a-3ABC

M.DNA Marker DL 2 000；1,6.RT-PCR products of 3ABC(1 311bp)；2.RT-PCR products of 3AB；3.PCR identification of recombinantplasmid of pET30a-3AB；4.Double digestion of recombinant plasmid ofpET30a-3AB；5.Recombinant plasmid of pET30a-3AB；7.RT-PCR products of3ABC；8.PCR identification of recombinant plasmid ofpET32a-3ABC；9.Double digestion of recombinant plasmid ofpET32a-3ABC；10.Recombinant plasmid of pET32a-3ABC

图1　3AB和3ABC基因片段扩增和琼脂糖凝胶电泳结果

Fig.1　Agrose electrophorsis of RT-PCR and identification of 3AB and3ABC gene

2.2　表达产物的分析、鉴定和纯化

对重组菌表达产物进行SDS-PAGE，结果可见30 ku左右的目的蛋白条带(3AB)和46ku左右的目的蛋白条带(3ABC)，均与预期大小一致(图2)，两种重组蛋白均在诱导后5h表达量最大；可溶性分析显示，3AB重组蛋白以不溶性包涵体形式存在于菌体中(图3)，而3ABC重组蛋白50%为可溶性表达，50%为包涵体形式表达(图4)；Westernblot分析发现这两种融合蛋白均能与口蹄疫病毒阳性血清发生免疫反应，具有良好的反应原性(图4)；用His·Bind蛋白纯化试剂盒分别对两种重组表达菌进行纯化后，得到的目的蛋白纯度均能达到90%以上(图3)。

M.蛋白分子质量标准；1.3AB重组菌未诱导表达产物；2.3AB重组菌诱导表达2 h产物；3.3AB重组菌诱导表达3h产物；4.3AB重组菌诱导表达4h产物；5.3AB重组菌诱导表达5h产物；6.3ABC重组菌未诱导表达产物；7.3ABC重组菌诱导表达2h产物；8.3ABC重组菌诱导表达3 h产物；9.3ABC重组菌诱导表达4h产物；10.3ABC重组菌诱导表达5 h产物

M.Protein Marker；1.Preinduced products of recombinant bacteria of3AB；2.Expression products of recombinant bacteria of 3AB afterinduced 2 h；3.Expression products of recombinant bacteria of 3ABafter induced 3 h；4.Expression products of recombinant bacteria of3AB after induced 4 h；5.Expression products of recombinant bacteriaof 3AB after induced 5 h；6.Pre-induced products of recombinantbacteria of 3ABC；7.Expression products of recombinant bacteria of3ABC after induced 2 h；8.Expression products of recombinantbacteria of 3ABC after induced 3h；9.Expression products ofrecombinant bacteria of 3ABC after induced 4 h；10.Expressionproducts of recombinant bacteria of 3AB after induced 5 h

图2　重组蛋白3AB和3ABC表达的SDS-PAGE分析

Fig.2　SDS-PAGE analysis of expression of recombinant proteins of3AB and 3ABC

M.蛋白分子质量标准；1.3AB重组菌未诱导表达产物；2.3AB重组菌诱导表达产物；3.3AB重组表达菌裂解后的上清；4.3AB重组表达裂解后的沉淀；5～6.纯化的3AB重组蛋白；7.3ABC重组菌未诱导表达产物；8.3ABC重组菌诱导表达产物；9.3ABC重组表达菌裂解后的上清；10.3ABC重组表达菌裂解后的沉淀；11～12.纯化的3ABC重组蛋白

M.Protein Marker；1.Pre-induced products of recombinant bacteria of3AB；2.Induced-expression products of recombinant bacteria of3AB；3.Supernatant of recombinant bacteria of 3AB after ultrasoundcracking；4.Deposition of recombinant bacteria of 3AB afterultrasound cracking；5-6.Purifiedrecombinant protein of3AB；7.Pre-induced products of recombinant bacteria of3ABC；8.Induced-expression products of recombinant bacteria of3ABC；9.Supernatant of recombinant bacteria of 3ABC after ultrasoundcracking；10.Deposition of recombinant bacteria of 3ABC afterultrasound cracking；11-12.Purified recombinant protein of 3ABC

图3　纯化重组蛋白3AB和3ABC的SDS-PAGE分析

Fig.3　SDS-PAGE analysis of purifiedrecombinant proteins 3AB and3ABC

M.蛋白分子质量标准；1.pET30a空载体表达菌；2.3AB重组表达菌；3.pET32a空载体表达菌；4.3ABC重组表达菌

M.Protein Marker；1.pET30a vector；2.recombinant bacteriapET30a-3AB；3.pET32a vector；4.Recombinant bacteria pET32a-3ABC

图4　重组蛋白3AB和3ABC的Western blot分析

Fig.4　Western blott analysis of recombinant proteins 3AB and 3ABC

2.3　FMDV非结构蛋白ELISA检测方法的初步建立和重组蛋白免疫活性检测

将纯化后的重组蛋白3AB和3ABC分别包被酶标板，摸索相应条件初步建立了3AB-ELISA和3ABC-ELISA检测方法。通过对FMDV标准阳性血清(A型、O型、C型和AsiaⅠ型)和10份FMDV疫苗免疫动物血清的检测，发现FMDV重组蛋白3AB和3ABC的检测结果基本一致，4种FMDV标准阳性血清OD值与阴性血清OD值的比值均大于2，判定为FMDV阳性；而免疫动物血清的OD值与阴性血清OD值的比值均小于2，判定为FMDV阴性，结果见表2。结果表明，本研究所表达的两种FMDV非结构重组蛋白均具有免疫活性，能够非特异性的检测不同血清型FMDV的非结构蛋白抗体，并且能够鉴别诊断感染动物和免疫动物。

表2　FMDV-3AB-ELISA和FMDV-3ABC-ELISA对血清样本的检测结果

Table 2　Results of detection antibody of FMDV in seral samples by3AB-ELISA and 3ABC-ELISA

注：“＋”为阳性；“－”为阴性。

Notes：“＋”Means positive；“－”Means negative.

3　讨论

在FMDV的几种非结构蛋白中，3D是最早用于诊断的非结构蛋白。人们最初认为，动物体内3D抗体的出现与病毒的感染有关，因此把3D蛋白称为病毒感染相关抗原(virusinfection associated antigen，VIAA)，检测其抗体是评价动物是否接触过口蹄疫抗原的重要指标，也是国际贸易必检项目。但是后来从疫苗免疫动物的体内也检测到3D的抗体，说明3D蛋白不能区分免疫动物和感染动物。研究表明感染动物可以产生针对2B的抗体，但这种抗体在ELISA试验中重复性不好，不宜作为检测抗体的抗原。LubrothJ等和Meyer R F等相继报道了以2C和3ABC为抗原来鉴别FMDV感染动物与免疫动物，Mezencio J M等测定了不同来源的动物血清2C抗体，免疫动物为阴性而感染动物全为阳性，但猪和牛血清中的2C抗体消退要比3ABC早，而且免疫牛的血清偶尔也可检测到2C的抗体。SilbersteinE等用3AB蛋白作为检测抗原，结果表明，检测3AB抗体可以作为区别感染与免疫的重要指标。Bergmann I E等比较了3A、3B、2C、3D和3ABC作为诊断抗原，应用间接ELISA试验检测感染牛的敏感性和准确性，以3A、3B和3ABC为抗原检出的结果与病毒分离和电转移免疫印迹试验检出结果相一致，尤其是3ABC效果最好。经过多年的研究实践，目前认为非结构蛋白3AB和3ABC抗体是鉴别FMDV感染与免疫的最可靠的指标，另外，同时配合其他非结构蛋白抗体的检测，如2B、2C抗体等，可以提高诊断的准确性。

本研究利用RT-PCR技术克隆得到亚洲1型口蹄疫病毒完整的非结构蛋白3ABC基因，全长1 311bp，经过序列比对分析发现其基因序列与A型、O型和C型FMDV-3ABC序列的同源性分别是90.01%,89.55%和84.06%，推导氨基酸的同源性为A型93.36%、O型90.02%、C型94.97%，表明3ABC基因确实比较保守，可以对这4种亚型的FMDV感染进行诊断，这与SorensenK J等的研究结果相一致。根据DNAStar等分子生物学软件对3ABC基因的分析发现，3ABC的亲水区和主要的抗原决定簇集中在基因序列中间的一段区域，结合前人的研究结果我们选择对3AB基因和部分3ABC基因(抗原位点集中区域)进行表达，以筛选免疫活性最好，最适于检测FMDV感染血清抗体的非结构蛋白，提高FMDV鉴别诊断的敏感性和特异性。本研究中表达的3AB和3ABC蛋白均能被FMDV抗血清识别，作为包被抗原进行ELISA也均能够与四种FMDV阳性血清反应，而且与FMDV疫苗免疫动物血清不反应，说明表达的两种非结构蛋白都能够用于鉴别诊断FMDV感染动物和免疫动物，但是哪种重组蛋白更为敏感、更适用于FMDV鉴别诊断还需要进一步证明。

研究中选用了两种原核表达载体pET-30a和pET32a，表达产物均为融合蛋白，带有6个组氨酸标签，便于后续纯化工作。其中pET32a载体由于带有硫氧还原蛋白(TrxA)元件，可促进表达蛋白二硫键的形成，有助于蛋白的可溶性表达，更好的保持蛋白的天然活性。本研究结果表明，pET-32a载体表达的FMDV非结构蛋白3ABC有50%是可溶性表达的，有50%是以包涵体形式表达，我们对两种形式的重组蛋白同时进行了纯化回收，ELISA结果表明两者的反应结果基本一致，抗原包被浓度也很接近。两者对于FMDV抗体反应是否具有敏感性的差异仍需进一步研究。在本研究中，FMDV-3AB和FMDV-3ABC两种重组蛋白均获得了高效表达，为大量制备FMDV诊断抗原奠定了基础。但是要建立成熟的FMD-ELISA鉴别诊断方法，并使之确认和标化，仍有很多工作需要进一步研究深入。