摘 要：通过致病力试验和免疫原性检测对肾型鸡传染性支气管炎病毒新疆株(IBVXJ-2株)进行生物学特性的研究。致病力检测结果证实，IBVXJ-2株可以致SPF鸡胚卷缩、僵化，EID50达10－8.3/0.1 mL；鸡胚肾细胞在接毒后96h出现皱缩、脱落等明显的细胞病变；对20日龄非免疫鸡攻毒后第2天，试验鸡出现甩鼻、伸颈张口呼吸等症状。将IBVXJ-2株抗原经乳化后接种1月龄非免疫鸡，在接种后22d和44 d用ELISA和HI检测到了IBV特异性抗体。
关键词：肾型鸡传染性支气管炎病毒；生物学特性；致病力；免疫原性
鸡传染性支气管炎(Infectiousbronchitis，IB)是鸡的一种急性、高度接触性病毒性呼吸道疾病，其特征是气管口罗音、咳嗽和打喷嚏。1930年在美国首先发现传染性支气管炎，最初出现典型的呼吸道症状，20世纪60年代发现有肾脏病变。我国20世纪50年代有IB的报道，1983年首次分离到肾脏病变型的鸡传染性支气管炎病毒(Infectiousbronchitis virus，IBV)。国内其他省区陆续也有肾型IB的报道。而且，肾型IB给养鸡业造成的经济损失比呼吸型更大。近年来，新疆地区经常发生以肾型病变为主的传染性支气管炎，主要侵害鸡的肾脏，造成病鸡肾脏肿大、苍白，有大量尿酸盐沉积，随后病鸡出现水泻和脱水，最终导致鸡的死亡，造成很大的经济损失。从新疆多个发病鸡场的发病鸡肾脏分离出了肾型鸡传染性支气管炎病毒，本研究拟对肾型鸡传染性支气管炎病毒新疆株IBVXJ-2进行生物学特性研究。
1 材料与方法
1.1 种毒
肾型鸡传染性支气管炎病毒新疆株(后简称IBVXJ-2株)由新疆畜牧科学院兽医研究所实验室分离、鉴定和保存。
1.2 试剂
甲醛为西安化学试剂厂生产，新生牛血清为中美合资兰州民海生物工程有限公司生产，胰酶和MEM为HyClone公司产品，IBVAntibody Test Kit购自美国IDEXX公司。
1.3 病毒的增殖与收获
将IBVXJ-2株病毒液做1∶100稀释，接种10日龄SPF鸡胚10枚(济南斯帕法斯家禽有限公司),0.2 mL/枚，置37℃孵化至36 h～40 h时取出5枚鸡胚，4 ℃放置4 h～12 h后收获尿囊液，剩余5枚鸡胚继续孵化至144 h，观察鸡胚变化。
1.4 致病力检测
1.4.1 对鸡胚致病力试验 将IBVXJ-2株尿囊液用生理盐水进行10倍系列稀释，取10－7、10－8、10－9、10－104个稀释度，分别接种10日龄SPF鸡胚，每个稀释度接种5枚，每枚尿囊腔接种0.1 mL，每日照蛋2次，144h后观察鸡胚病变并计算鸡胚半数感染量(EID50)。
1.4.2 对细胞致病力试验 SPF鸡胚孵化至18日龄，无菌取出鸡胚的肾脏组织，用灭菌的D-Hanks冲洗3遍～4遍，用无菌眼科剪将肾脏剪成1mm～2 mm大小，D-Hanks再冲洗2遍后，加入10倍量的胰酶-EDTA进行消化，加入含100 mL/L新生牛血清(56℃灭能30 min)的MEM培养基，之后用100目铜网过滤至细胞培养瓶中，吸取0.1 mL细胞悬液，加Hanks液0.9mL，混合后滴于细胞计数板上，在倒置显微镜下计数，细胞浓度＝(4个大方格内细胞数/4)×104×稀释倍数。以5×105/mL细胞浓度为宜，分装到细胞培养瓶中，在37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养24h，长成单层细胞后接种5%的IBVXJ-2株尿囊液，同时设立不加IBVXJ-2株尿囊液的细胞作为对照。每天观察细胞病变。
1.4.3 对鸡致病力试验 将1日龄非免疫雏鸡(购自新疆康盛种禽公司)30只在禽用负压隔离器(苏州市苏杭实验动物设备厂)中饲养，到20日龄时分为3组，每组10只，第1组滴鼻接种病毒尿囊液0.1mL/只，第2组气管注入病毒尿囊液0.1 mL/只，第3组肌肉注射生理盐水0.1mL/只，作为对照。分别饲养在禽用负压隔离器中，每天观察纪录，观察14 d。
1.5 病毒的免疫原性测定
IBVXJ-2株尿囊液100 mL加入100 mL/L甲醛1 mL(甲醛终浓度为1mL/L)进行灭活后，将灭活的抗原(含4%吐温-80)与油佐剂(白油94份，司本80 6份，硬脂酸铝0.5份)以1∶1比例用胶体磨进行乳化。将1月龄SPF鸡14只分为2组，免疫组10只接种乳化抗原0.5mL/只；对照组4只不接种IB抗原，作为对照。IBV抗原接种后分别于22 d和44 d采血10份，对照组分别于22 d和44d采血4份，分离血清，用ELISA和HI 检测相应的特异性抗体。
1.5.1 间接ELISA 将分离的血清用稀释液做1∶500倍稀释，用间接ELISA检测IB抗体，具体操作步骤按照IBVAntibody Test Kit说明书进行，用Model 680型酶标仪(Bio-RADLaboratories，Inc.)读取OD650的数值，计算方法为：
通过关系式：log10滴度＝1.09(log10S/P)＋3.36计算出抗体滴度。结果判定方法为：若S/P值≥0.2或滴度大于396，则判定为阳性，否则判定为阴性。
1.5.2 IBHI抗体检测 参照文献进行。先检测IB诊断抗原(青岛易邦生物工程有限公司馈赠)的血凝价，根据IB抗原血凝价配制4HA50的工作液，加入到2倍系列稀释的待检血清中，每孔加入0.025mL，并设生理盐水和IBV对照，充分振荡混匀后，在37 ℃作用30 min；再加入10 mL/L鸡红细胞悬液置20 ℃～30 ℃，20min～40 min后判定结果，使50%红细胞凝集抑制的最高稀释度作为判定终点。
2 结果
2.1 病毒的增殖与收获
将36 h～40 h取出的5枚鸡胚，4 ℃放置4 h～12 h后分别收获尿囊液，置－20 ℃备用；孵化至144h的5枚鸡胚，均出现鸡胚卷缩、僵化的鸡传染性支气管炎典型病变。
2.2 IBVXJ-2株的致病力
2.2.1 对鸡胚的致病力 将IBVXJ-2株病毒液接种SPF鸡胚后，所有出现病变的鸡胚均有典型的鸡传染性支气管炎病理变化，鸡胚卷缩，僵硬，胚体表面僵化，有纤维素附着，鸡胚卷缩至正常胚的1/3，对照组鸡胚发育正常。
将不同稀释度的IBVXJ-2株尿囊液接种SPF鸡胚，继续孵育和观察，统计鸡胚病变数，用Reed-Muench法计算鸡胚半数感染量(EID50)，见表1。
表1 IBVXJ-2株对SPF鸡胚的半数感染量(EID50)检测
Table 1 The SPF chicken embryo EID50 test results of IBVXJ-2 strain
病毒稀释 Dilution of the virus | 观察结果 Observation results | 累计结果 Accumulated results | |||
病变数 Number of pathogenic embryos | 无病变数 Number of non- pathogenic embryos | 病变/% Morbidity | 病变/% Morbidity | ||
10－7 | 4 | 1 | 80 | 90 | |
10－8 | 3 | 2 | 60 | 63 | |
10－9 | 2 | 3 | 40 | 25 | |
10－10 | 0 | 5 | 0 | 0 |
距离比例＝
63％－50％
63％－25％
＝0.3，则EID50＝10－8. 3/0.1 mL
2.2.2 对细胞的致病力 将50 mL/L IBVXJ-2株尿囊液接种单层鸡胚肾细胞，在接毒96h以后出现明显的细胞皱缩、脱落的病变(图1)；不加IBVXJ-2株尿囊液的细胞在96 h后未出现任何病变，细胞发育一直正常(图2)。
2.2.3 对鸡的致病力试验 对试验鸡通过滴鼻、气管注入等途径进行攻毒，观察14d(表2)，第1组和第2组鸡攻毒后第2天精神沉郁，饮食减少，出现甩鼻、伸颈张口呼吸症状；第3组鸡无呼吸困难症状。
图1 接毒96 h后病变鸡胚肾细胞
Fig.1 Pathological changes in the renal cells of chicken embryo 96h after inoculation
图2 正常鸡胚肾细胞
Fig.2 The normal renal cells of chicken embryo
表2 IBVXJ-2株对20日龄非免疫鸡的致病力检测
Table 2 The results of pathogenic test of IBVXJ-2 strain to 20-daynon-immune chickens
分组 Groups | 攻毒途径 Challenge route | 剂量/mL Dose | 试验鸡数/只 Chicken numbers | 发病率 Morbidity |
第1组 Group1 | 滴鼻 Nose dropping | 0.1 | 10 | 8/10 |
第2组 Group2 | 气管注入 Via trachea | 0.1 | 10 | 9/10 |
第3组 Groups3 | 生理盐水对照 Normal saline control | 0.1 | 10 | 0/10 |
2.3 免疫原性测定
将IBVXJ-2株的抗原接种1月龄非免疫鸡后，分别于22 d和44d采血，分离血清，用ELISA和HI检测IB的特异性抗体(表3和表4)。
表3 IBVXJ-2株免疫鸡的ELISA抗体检测
Table 3 The ELISA antibody titers of chicken immunized with IBVXJ-2strain
分组 Groups | 接种后天数/d Days post-inoculation | 血清样品数 Number of samples | 血清样品OD值/OD655nm The optical density values of samples | 平均值 Average | 抗体滴度 Antibody titers |
免疫组 Vaccinationgroup | 22 | 10 | 0.386、0.250、0.527、0.360、0.320、 0.385、0.420、0.392、0.415、0.391 | 0.384 | 2 051 |
44 | 10 | 0.908、0.815、0.212、0.516、0.872、 0.921、0.721、0.843、0.810、0.785 | 0.740 | 2 269 | |
对照组 Control group | 22 | 4 | 0.027、0.093、0.130、0.058 | 0.077 | 133 |
44 | 4 | 0.053、0.121、0.208、0.067 | 0.112 | 322 |
Table 4 The HI antibody titers of chicken immunized with IBVXJ-2strain
分组 Groups | 接种后天数/d Days post-inoculation | 样品数 Number of samples | HI抗体效价/log2 HI antibody titers | 平均值/log2 Average |
免疫组 Vaccinationgroup | 22 | 10 | 3、3、4、4、4、4、6、6、7、9 | 6.1 |
44 | 10 | 4、4、4、4、6、6、6、8、9、9 | 6.0 | |
对照组 Control group | 22 | 4 | 0、1、1、2 | 0.1 |
44 | 4 | 2、2、3、1 | 0.5 |
试验表明，IBVXJ-2株可以致鸡胚出现典型的传染性支气管炎病毒所致的病理变化，EID50为10－8 3/0.1mL；试验鸡出现典型的呼吸系统症状；在接毒后96h就引起鸡胚肾细胞皱缩、脱落，对鸡胚肾细胞具有很强的致病力，表明IBVXJ-2株具有较强的毒力。
本试验用乳化的IBVXJ-2株接种非免疫鸡，分别用HI方法和ELISA方法对免疫后22 d和44 dIB抗体进行检测，结果显示IB的ELISA抗体效价达到2 269，IB的HI抗体效价达到6.1log2，表明IBVXJ-2株具有良好的免疫原性，可以刺激机体产生特异性的免疫抗体，同时也说明用IBVXJ-2株制备疫苗预防鸡肾型传染性支气管炎的可行性。
近年来，新疆一些养鸡场虽然接种了鸡新城疫-传染性支气管炎二联弱毒活疫苗，但以肾脏肿大、腹泻为主要症状的鸡肾型传染性支气管炎的病例不断增加。由于该病病程长，很难用药物治愈，给新疆养鸡业造成很大的损失。鉴于新疆地区肾型传染性支气管炎的多年流行，本试验旨在从新疆分离株中筛选出免疫原性优良的肾型IBV制苗毒株，使疫苗的免疫效果更具有针对性。本试验结果表明，肾型鸡传染性支气管炎病毒IBVXJ-2株不仅具有较强的毒力，而且具有良好的免疫原性，是良好的IB制苗备选毒株。
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