摘 要：根据已发表的犬新孢子虫NcSRS2基因序列，设计1对含有EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点的引物。以提取犬新孢子虫虫体基因组DNA为模板，应用PCR扩增获得NcSRS2ORF基因片段，将此基因片段克隆到pMD18-TSimple载体上，用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切该片段，回收得到含有两个酶切位点黏端的NcSRS2ORF基因，将此基因片段克隆至相同酶切回收后的PGEM-4T-2原核表达载体中，获得重组质粒pGEX-NcSRS2，经PCR鉴定，限制性内切酶分析和克隆片段序列测定比较，证实了重组质粒的正确性。
关键词：犬新孢子虫；聚合酶链反应；NcSRS2基因；原核表达载体PGEM-4T-2
新孢子虫病(Neosporosis)是由犬新孢子虫(Neosporacaninum)寄生于宿主所引起的一种原虫病。感染新孢子虫的动物临床症状主要表现为母畜流产、死胎或新生幼畜运动障碍和神经系统等疾病，该病给畜牧业生产造成了巨大的经济损失。新孢子虫是一种专性的细胞内寄生虫，国外学者在新孢子虫的致密颗粒棒状体里及速殖子表面发现了新孢子虫表面蛋白NcSRS2。NcSRS2表面蛋白介导其黏附及入侵宿主细胞，可以作为酶联免疫吸附试验有效的抗原成分，是最有希望的新孢子虫疫苗的侯选抗原。本研究利用原核表达载体pGEX-4T-2，构建犬新孢子虫NcSRS2基因原核表达质粒，目的在于将体外表达的蛋白作为诊断抗原或免疫原，为进一步建立特异性新孢子虫ELISA诊断试剂盒、研制新孢子虫NcSRS2基因疫苗奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 新孢子虫NC-1虫株及菌株 新孢子虫NC-1株由日本北海道带广畜产大学原虫病研究所中心惠赠，本课题前期工作中由细胞培养传代进行增殖，液氮保存，大肠埃希菌BL21为延边大学农学院动物医学系微生物实验室保存。
1.1.2PCR引物 根据GenBank中发表的NcSRS2基因序列自行设计，由上海英俊生物技术有限公司合成。两条引物5′端分别引入了EcoRⅠ、NotⅠ限制性内切酶切点(下划线部分)。上游引物为5＇-ACGAATTCCCAAACTCAGTGCGTCTC-3＇，下游引物为5＇-ACGCGGCCGCCGAAGGCAACTCGTCA-3＇。
1.1.3 主要试剂 限制性内切酶EcoRⅠ、NotⅠ、ExTaq酶、pMD18-T Simple载体、Agarose Gel DNAExtraction Kit、DNA Marker均为宝生物工程(大连)有限公司产品，表达载体pGEX-4T-2购自AmershamPharmacia公司，由延边大学农学院动物医学系微生物实验室保存。
1.2 方法
1.2.1 NcSRS2基因PCR扩增 以抽提的新孢子虫基因组DNA为模板，依次加入去离子水17.25 μL，10×PCR缓冲液2.5μL,2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，模板DNA 1 μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL) 0.25 μL。反应条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s,62 ℃ 2 min，72 ℃ 1min，进行30个循环；最后于72 ℃ 10 min。PCR产物经10g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。用DNA胶回收试剂盒回收PCR产物，回收后取1 μL电泳，纯化的PCR产物于－20 ℃储存备用。
1.2.2 目的基因与克隆载体的连接、转化及鉴定 将纯化的PCR产物与pMD18-T载体于16 ℃连接2h，按常规方法转化至感受态大肠埃希菌BL21。在含Amp的LB培养板上挑取10个白色单菌落，将其接种于含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB培养液中，37 ℃剧烈振摇培养12h，按微量碱裂解法提取质粒。重组质粒经PCR和EcoRⅠ、NotⅠ双酶切鉴定。将PCR和酶切鉴定为阳性的克隆送往上海生工生物工程技术服务有限公司测序。
1.2.3 pMD18-NcSRS2重组质粒及表达载体双酶切 pMD18-NcSRS2重组质粒经EcoRⅠ、NotⅠ双酶切，同时载体pGEM-4T-2也进行双酶切。酶切后的产物均由宝生物工程(大连)有限公司AgaroseGel DNA Extraction Kit进行回收，回收后各取1 μL电泳，4 ℃保存备用。
1.2.4 目的基因与表达载体的连接和转化 将酶切的目的基因与载体按3∶1的体积混合，在T4DNA连接酶的作用下16℃过夜，将连接产物转化至大肠埃希菌BL21感受态细胞涂布平板，挑取单个白色菌落提取质粒进行酶切和PCR鉴定。命名为pGEM-NcSRS2。
1.2.5 目的基因的序列测定与鉴定 将初步鉴定的重组质粒pGEM-NcSRS2送上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定，获得目的基因序列后，借助分析软件DNAMAN，将目的基因与GenBank中发表的基因序列进行核苷酸的同源性比较。
2 结果
2.1 目的基因片段的扩增
以提取的新孢子虫基因组DNA为模板，经PCR反应扩增出大小为1 100 bp的新孢子虫DNA片断，与预期结果一致(图1)。
2.2 重组质粒pMD18-NcSRS2 PCR鉴定
以初步鉴定为阳性的重组克隆质粒为模板进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳，结果显示，扩增出DNA片段大小与目的片段大小一致(图2)，说明重组质粒含有目的基因。
M.DNA标准DL 2 000；1.犬新孢子虫标准DNA；2.犬新孢子虫DNA扩增产物； 3.水对照
M.DNA Marker DL 2 000；1.The standard N.caninum DNA；2.N.caninum DNAfragment； 3.Water control
图1 犬新孢子虫PCR扩增结果
Fig.1 PCR results of N.caninum
M.DNA标准DL 2 000；1～2.犬新孢子虫重组质粒；3.犬新孢子虫DNA扩增产物；4.水对照
M.DNA Marker DL 2 000；1-2.N.caninum recombinant plasmid；3.N.caninumDNA fragment； 4.Water control
图2 重组质粒的PCR鉴定结果
Fig.2 Identification of N.caninum recombinant plasmid by PCR
2.3 重组质粒pMD18-NcSRS2的酶切鉴定
用EcoRⅠ、NotⅠ对初步筛选为阳性的重组克隆质粒进行酶切鉴定，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳。结果显示，经EcoRⅠ、NotⅠ酶切，得到了2692 bp和1 100 bp的两条片段(图3)，说明目的基因片段已成功地克隆到pMD18-T Simple载体。
2.4 重组质粒pMD18-NcSRS2的测序鉴定
测序结果与GenBank中发表的该基因ORF的序列同源性为99.8%，说明目的基因(NcSRS2)已经被成功克隆到pMD18-TSimple载体上。
2.5 重组质粒PGEX-4T-NcSRS2的酶切鉴定
用EcoR1、Not1对初步筛选为阳性的重组亚
克隆质粒进行酶切鉴定，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳。结果显示，经EcoR1、Not1酶切，得到了4 988 bp和1 100bp的两条片段(图4)，说明目的基因片段已成功地克隆到PGEX-4T-2载体。
2.6 重组质粒pGEM-4T-NcSRS2的测序鉴定
测序结果与GenBank中发表的该基因ORF的序列同源性为99.2%，说明目的基因已经从重组质粒pMD18-NcSRS2亚克隆到原核表达载体pGEM-4T-2载体上，成功地构建了NcSRS2基因的原核表达载体pGEM-NcSRS2。
M1.DNA标准DL 2 000；1.重组质粒酶切产物；2.重组质粒；M2.DNA标准DL 15 000
M1.DNA Marker DL 2 000；1.Restriction enzyme digestion ofrecombinant plasmid；2.Recombinant plasmid；
M2. DNA Marker DL 15 000
图3 PMD18-NcSRS2重组质粒的酶切鉴定
Fig.3 Identication of pMD18-NcSRS2 by restricted endonucleasedigestion
M1.DNA标准DL 2 000；1.重组质粒酶切产物；2.重组质粒pGEM-NcSRS2；M2.DNA标准DL 15 000
M1.DNA Marker DL2 000；1.Enzyme digestion products of recombinantplasmid；2.The recombinant plasmid of pGEM-NcSRS2；M2.DNA Marker DL15 000
图4 PGEM-4T-NcSRS2重组质粒的酶切鉴定
Fig.3 Identication of pGEM-4T-NcSRS2 by restricted endonucleasedigestion
3 讨论
由于原核表达系统常受到目的基因本身结构、转录水平调控和蛋白质折叠诸多因素的影响，本研究所用的融合表达载体pGEX-4T-2，该载体带有非常强的tac启动子，融合蛋白表达系统可以克服转录与转录后水平对外源基因表达带来的不利影响，是一种高效的蛋白表达载体，GST标签便于目的蛋白的进一步纯化。考虑到重组质粒最终要在大肠埃希菌中进行表达，且便于克隆的需要，在引物设计时，在上游引物和下游引物上加了EcoRⅠ、NotⅠ两个酶切位点。
自从1988年Dubey首次分离得到犬新孢子虫以来，对其研究有了一定的进展，一些重要的功能基因得到了克隆，如NC-P36、NC-P43(NcSRS2)等。这些功能基因的发现有助于了解犬新孢子虫的细胞生物学特性和制定相应的诊断、预防措施。其中NcSRS2基因的ORF大小为1206 bp，编码402个氨基酸，表达分子质量为43ku。其作用是介导虫体入侵宿主细胞，抗NcSRS2基因的单克隆抗体能够阻断这一作用。研究证明NcSRS2基因可用于诊断和疫苗的免疫原，该基因在刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)上不存在，因此以该基因编码的蛋白作为抗原与T.gondii不发生交叉反应，提高了诊断的特异性。
重组质粒PGEX-NcSRS2可在大肠埃希菌中进行表达，表达产物可作为诊断抗原，进行新孢子虫的免疫学和血清学特异性诊断方法的建立，进而研制出低成本、高特异性的诊断试剂盒。因此，本研究所构建的重组质粒PGEX-NcSRS2为犬新孢子虫病的进一步研究奠定了基础。
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