摘 要：采集健康鸡肝素抗凝血，按常规方法分离外周血淋巴细胞并于体外培养24h后，加入不同剂量的新鱼腥草素钠/刀豆素A(ConA)，继续培养44h后，以MTT法测定新鱼腥草素钠对淋巴细胞增殖的影响。结果表明，新鱼腥草素钠在体外具有刺激淋巴细胞增殖的能力，且与ConA具有协同作用；进一步分析表明，不同给药剂量的新鱼腥草素钠对淋巴细胞的影响不同，其中以终浓度为250mg/L效果最明显。
关键词：新鱼腥草素钠；淋巴细胞；鸡
新鱼腥草素钠(Sodium newhoutluyfonate，SNH)是一种人工合成的鱼腥草素类似物，具有与鱼腥草挥发油、合成鱼腥草素相似的药理作用，对提高机体的免疫力、感染性疾病的预防和治疗有着重要意义。目前，关于鱼腥草和合成鱼腥草素的报道，多集中在其广谱抗菌、抗病毒以及抗炎镇痛等作用的研究；关于其对家禽免疫功能的影响及在养禽业中应用的，尚未见详细报道。本试验采用MTT法比较了不同浓度新鱼腥草素钠对体外培养的鸡外周血淋巴细胞增殖的影响作用，并筛选出效果最佳的药物浓度，从而为后续体内试验确定药物剂量提供参考依据，为探讨新鱼腥草素钠免疫增强作用和机理奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 新鱼腥草素钠注射液 江苏动物药品工程技术研究中心制备，规格10 mL(20 mg)。
1.1.2 主要试剂 青霉素钠为哈药集团制药总厂产品，硫酸链霉素为华北制药股份有限公司产品，RPMI-1640培养液为Gibco公司产品，新生牛血清为杭州四季青生物材料有限公司产品，刀豆素A(concanavalinA，ConA)、噻唑蓝(thiazolylblue，MTT)为Sigma公司分装产品，淋巴细胞分离液为上海华精生物高科技有限公司产品，二甲基亚枫(dimethylsulphoxide，DMSO)为上海生工生物工程技术服务有限公司产品，无钙镁Hanks液为本实验室配制。
1.1.3 主要仪器 MCO-15AC型CO2培养箱为日本SANYO公司产品，PM-6型倒置显微镜为日本Olympus公司产品，At-838型自动酶标分析仪为上海安泰分析仪器有限公司产品，细胞培养板为美国Corning公司产品。
1.2 方法
1.2.1 外周血淋巴细胞的制备 取50日龄健康鸡购自江苏省家禽科学研究所，通过心脏采集肝素抗凝血5mL，制备淋巴细胞。用含有100单位/mL青链霉素、100mL/L新生牛血清的RPMI-1640培养液调整细胞密度至1×107个/mL后，转入细胞培养瓶并于39.5℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养24 h。
1.2.2 外周血淋巴细胞增殖反应 待上述细胞生长至单层后，去除培养上清，用等量的新鲜培养液悬浮细胞，并分装于96孔细胞培养板中(80μL/孔)。按照表1加入不同剂量的新鱼腥草素钠/ConA(终浓度5 mg/L)至总体积为200μL；同一剂量的试验组共设置12个重复孔，并设立不同的对照(表1)。将细胞放入39.5 ℃、体积分数为5%的CO2培养箱中继续培养44h。取出细胞板，每孔加入20 μL MTT液(以RPMI-1640培养液配成5 g/L)；继续培养4h后，弃去培养孔中的上清液，每孔加入100 μL DMSO，充分混匀；于室温避光静置15 min后，测定570nm波长的吸光值(OD570)，并计算平均值，作为T淋巴细胞增殖的指标。
表1 试验分组及加药方法
Table 1 Grouping and treatment of the test
组别 Groups | SNH终浓度/(mg·L－1) Final concentration of SNH | ConA终浓度/(mg·L－1) Final concentration of ConA | |
试验组Ⅰ Experimental groupⅠ | 1 | 500 | － |
2 | 250 | － | |
3 | 125 | － | |
4 | 62.5 | － | |
试验组Ⅱ Experimental group Ⅱ | － | 5 | |
试验组Ⅲ Experimental group Ⅲ | 1 | 500 | 5 |
2 | 250 | 5 | |
3 | 125 | 5 | |
4 | 62.5 | 5 | |
对照组 Control group | － | － |
2 结果
2.1 SNH对淋巴细胞增殖的影响
在试验组Ⅰ，单独使用SNH进行的MTT试验的OD570值均高于对照组(表2)，表明SHN在体外具有刺激淋巴细胞增殖的能力，并且这种影响与药物剂量有关，但不是随剂量的增加而增强，其中以中等浓度(250mg/L)效果最为明显(图1)，表明了合适剂量的新鱼腥草素钠对刺激淋巴细胞的增殖具有一定的作用。
表2 新鱼腥草素钠对淋巴细胞增殖的影响
Table 2 Effects of SNH on lymphocyte proliferation
组别 Groups | OD570 | |
试验组Ⅰ Experimental group Ⅰ | 1 | 0.154±0.015a |
2 | 0.171±0.024a | |
3 | 0.158±0.017a | |
4 | 0.140±0.031a | |
试验组Ⅱ Experimental group Ⅱ | 0.149±0.017a | |
试验组Ⅲ Experimental group Ⅲ | 1 | 0.163±0.021a |
2 | 0.257±0.020b | |
3 | 0.222±0.017c | |
对照组 Control group | 0.118±0.027a |
Note： Different letters in same column indicate significantdifference(P＜0.05).
2.2 ConA对淋巴细胞增殖的影响
在试验组Ⅱ，单独使用ConA进行的MTT试验的OD值也高于对照组(表2)。进一步分析表明，使用5 mg/L ConA相当于62.5mg/L～125 mg/L的SNH刺激能力(图1)。
2.3 SNH和ConA对淋巴细胞增殖的影响
在试验组Ⅲ，联合使用SNH和ConA进行的MTT试验的OD值明显高于对照组(P＜0.05)，同时也均高于单独使用SNH或ConA(表2)，表明SNH与ConA具有协同刺激淋巴细胞增殖的能力。进一步分析显示，试验组Ⅲ中，SNH刺激淋巴细胞增殖具有和试验组Ⅰ相似的剂量相关性(图1)。
图1 新鱼腥草素钠对淋巴细胞增殖影响的规律
Fig.1 Effects of SNH on lymphocyte proliferation
3 讨论
SNH为天然鱼腥草的有效成分鱼腥草素同系列的亚硫酸氢钠合成物，不仅具有抗菌、利尿、镇咳等作用，而且还发现其对免疫功能也有很好的调节作用，值得进一步开发和探讨。本试验以SNH对体外培养的鸡外周血淋巴细胞增殖的影响作用为例，通过对鸡外周淋巴细胞增殖的检测，揭示了SNH具有增强免疫的潜在作用；同时还筛选出效果最佳药物浓度，从而为后续体内试验确定药物剂量提供参考依据。
淋巴细胞增殖是反映机体细胞免疫功能最直接的指标。本试验结果证明，SNH既能单独又能协同ConA刺激淋巴细胞增殖，这与邵兰等用合成鱼腥草素钠对脾切除模型小鼠淋巴结T淋巴细胞增殖能力的试验结果一致。有报道表明，新鱼腥草素钠对动物细胞免疫具有调节作用，尤其是对T细胞作用最为明显。本试验结果还表明，SNH对体外淋巴细胞增殖的影响具有剂量依赖性。有研究比较了不同浓度的鱼腥草素同系物对小鼠免疫功能的作用发现，随着浓度的增加其免疫促进作用增强，但当浓度过高时其增强作用有所下降。
本试验采用的MTT法在参照现有相关报道的同时，进行一些细节的改进。目前有关MTT法的操作大多是将调整好细胞密度的细胞悬液直接加入到培养板培养，而本试验是将调整好细胞密度的细胞悬液先在细胞瓶中培养24h后再转入培养板，这样不仅提高了细胞活性，而且保证了各孔细胞数量的均一，从而减少各孔OD值的系统误差。
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