分支杆菌分泌蛋白研究进展

摘　要：对近年来分支杆菌分泌蛋白研究进展进行了简要综述。利用杂交技术将牛分支杆菌基因组和结核分支杆菌复合物基因组相比较，显示在牛分支杆菌基因组中共有11处基因缺失；早期滤液成分是分支杆菌在生长期间分泌的相关蛋白群，目前的研究倾向于将存在于结核分支杆菌培养滤液中的蛋白分为3个主要的群。结核分支杆菌全基因组测序的完成，使得分支杆菌分泌蛋白质研究从分离鉴定到功能研究都有了很大的进步。相信随着研究的深入，更多的分泌蛋白质将被发现。

关键词：牛分支杆菌；结核分支杆菌；分泌蛋白

牛结核病是由牛分支杆菌(Mycobacteriumbovis)和结核分支杆菌(M.tuberculosis)所引起的一种人兽共患的慢性消耗性传染病，可通过病畜传染给人类或其他动物。牛结核病在许多发达国家已被控制，但在许多发展中国家，它依然威胁着亿万人民的健康。至今，牛结核病所造成的损失大于牛的其他各种疾病所造成损失的总和。我国现有结核病人600万，每年死亡28万。由于人类与牛的关系(牛奶、牛肉和耕牛)较其他动物更为密切，10%以上的人结核病是由牛分支杆菌引起，因此牛分支杆菌是人结核病的重要传染源。对奶牛进行牛结核病监测和净化是从根本上控制人结核的重要手段。世界卫生组织专家委员会第七次会议报告指出：“除非扑灭牛结核病，否则人类结核病的控制是不会成功的。”

研究证明机体主要依靠细胞免疫抵抗分支杆菌的感染，而分支杆菌的分泌蛋白是宿主对分支杆菌感染早期所能识别的重要抗原，可引起T淋巴细胞及B淋巴细胞免疫反应。近10多年来，人们对分支杆菌培养液中的分泌蛋白进行了广泛的研究，发现分支杆菌生长期分泌的蛋白对结核病的保护性免疫是很重要的，对结核病的预防和诊断具有重要意义。本文就近年来有关分支杆菌分泌蛋白研究进展进行简要综述。

1　牛分支杆菌与结核分支杆菌基因组和分泌蛋白的比较

1.1　基因组

牛分支杆菌AF2122/97型的基因组全长为4 345 492 bp，GC含量为65.63%，含有3952个蛋白编码基因，包括一个原噬菌体和42个IS序列。其基因组与结核分支杆菌H37Rv型基因组在核酸水平上的同源性超过99.95%，显示了共线性和不明显的易位、重复或倒位。利用杂交技术将牛分支杆菌基因组和结核分支杆菌复合物基因组相比较，结果显示在牛分支杆菌基因组中共有11处基因缺失，缺失基因大小范围约为1kb～12.7kb。令人惊奇的是牛分支杆菌基因序列仅有一个基因座TbD1，包括mmpS6和mmpL6的5′区，TbD1在现有的大多数结核分支杆菌菌株中均不存在，TbD1的缺失可能与阻止特异性脂类进入结合分支杆菌细胞壁有关。总的来说，缺失是形成牛分支杆菌基因组的主要机制。细胞壁成分和分泌蛋白也表现出极大的变异，表示它们可能在宿主－细菌相互作用或免疫逃避中起作用。此外，没有一个基因是牛分支杆菌独有的，暗示有差别的基因表达可能是结核分支杆菌和牛分支杆菌宿主向性的关键。

Behr M A等在结核分支杆菌全基因组测序完成的基础上，用基因芯片技术对来自世界各地的牛分支杆菌BacillusCalmette-Guerin(BCG)株与MTBH37Rv进行比较，发现共有RD1-RD16等16个区(包括129个ORF)存在差异，不同的BCG与牛分支杆菌之间在RD1、RD2、RD8、RD14和RD16五个区段(包括38个ORF)存在差异。所有BCG菌株均缺失RD1区，该区至少有9个ORF。如能证实这些差异基因不是毒力基因，而是强的保护性免疫靶抗原，如RD1区的ESAT-6和CEP10，就可作为重组表达改造BCG的靶基因，有可能获得优于BCG的免疫保护效果。DaugelatS等克隆了RD1中的11个ORF，并成功的表达及纯化了相应的蛋白。

分泌蛋白基因中最引人注目的变异是MPB70和MPB83在牛分支杆菌中的高度表达。MPB83是糖基化的蛋白，与细胞壁相结合。MPB70是一个外分泌蛋白，占牛分支杆菌培养滤液蛋白的10%，而在结核分支杆菌H37Rv株中仅有少量产生。免疫学研究揭示，MPB70在牛分支杆菌BCG及牛分支杆菌Ravenel株有高度特异性。

1.2　分泌蛋白

早期滤液的成分一般认为是细菌在生长期间分泌的相关蛋白群，研究所得结果提示存在于结核分支杆菌培养滤液中的蛋白可分为3个主要的群：①分泌蛋白：由结核分支杆菌在培养的最初几天内大量产生。它们在培养基内大量积聚，但在完整杆菌内仅有微量存在。②另一种分泌蛋白：分支为杆菌在生长期间细胞外壁逐渐释放的蛋白，这些蛋白的浓度在培养期间持续增加。③胞浆抗原(cytoplasmicantigen)：由死菌释放，表现为在对数生长期晚期这类物质突然以高浓度出现于培养滤液中。这些蛋白的出现与异柠檬酸脱氢酶(isocitratedehydrogenase，ICD)的大量释放有良好的相关性。故ICD的大量出现提示实质性的自溶已发生。

迄今为止已从结核分支杆菌和牛分支杆菌发现了多种蛋白，但这两种分支杆菌分泌蛋白大同小异，如MPB63和MPT63的编码基因只在474位上的有一个核苷酸不同，两个蛋白的氨基酸序列完全相同。大部分结核分支杆菌的MPT蛋白与牛分支杆菌BCG个体蛋白的初级结构之间有明显的相似性。

2　分支杆菌分泌蛋白的研究方法

自从1891年Koch发现结核菌素，Siebert于1924年用饱和硫酸铵沉淀法制得结核菌素纯化蛋白衍生物(PPD)以来，随着蛋白质组学与分子生物学研究技术的不断发展，不断有新的分泌蛋白被发现。AndersenP等发现刺激免疫反应成分主要是集中在4 ku～11 ku和26 ku～35ku范围的蛋白分子，已知的有Ag85复合体、ESAT-6、MPT64、MPT32等。

2.1　蛋白分离方法

对结核杆菌培养滤液进行电泳是最常用的蛋白分离方法。聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gelelectrophoresis，PAGE)为首先使用的方法，按分子大小及所负电荷对蛋白进行分离，缺点为某些蛋白表现为融合带。以十二烷基磺酸钠-PAGE (sodiumdodecyl sulfate-PAGE，SDS-PAGE)分离法是基于分子筛的作用，可观察到不同的条带，至少有100种以上的蛋白条带。一维(onedimension)电泳不能满足于有许多组成成分的分离。而双向电泳(two dimension electrophoresis，2D-E)非常有效，可产生精确的单个斑点。在培养的第2周～第10周之间，每周所获的结核分支杆菌培养液的2D-E有非常特征性的变化。有些蛋白斑点出现很早，并逐渐变得明显以至变弱。此结果表明，这些蛋白由分支杆菌细胞动态分泌。以后出现的斑点，在细菌溶解现象发生后变强，表明这些蛋白是非分泌性的，因为溶解于细胞质内的可溶性蛋白在细菌溶解时出现于培养液内。此时分泌性蛋白在数量上占优势。因此，最好由早期培养滤液进行分泌蛋白纯化。DanielTM等于1970年利用凝胶过滤、二乙基氨基乙基-纤维素层析以及区带电泳的方法，从结合分支杆菌H37Ra培养滤液中纯化出两种蛋白a1和a2，这两种蛋白是培养滤液的主要成分，所带电荷不同，但分子质量相似，其中a2就抗血清及作为皮试抗原而言均具有抗原性。

NagaiS等利用定量免疫蛋白电泳和ELISA以及针对结核分支杆菌及牛分支杆菌纯化蛋白的单特异性抗血清(monospecificantisera)方法，对一系列分支杆菌抗原进行了测定，并对每种培养液中的蛋白及细菌经超声碎裂后的蛋白相关比率进行定位指数计算。结果发现细菌细胞质的几种蛋白定位指数为0，而分泌蛋白定位指数介于4.6～10.50之间。定位指数表明分泌效率的不同或分泌蛋白黏附于细菌表面的不同倾向。AndersenP等以SDS-PAGE结合ELISA的方法对分支杆菌培养滤过蛋白进行测定，方法为短期培养滤液首先经SDS-PAGE后，被转移至硝酸纤维膜上，并与针对分支杆菌抗原的单克隆抗体孵育，选择与标记了过氧化物酶的兔抗鼠免疫球蛋白的抗体相结合的条带，随之以5,5′，3,3′-四甲联苯胺染色。ELISA法为由0d～14 d的短期培养滤液以1∶2稀释于0.1 mol/L碳酸氢钠缓冲液(pH9.6)中，用来包被聚苯乙烯微滴板，室温条件下与不同的McAb在最适浓度下孵育2 h，然后与1∶1000稀释的过氧化物酶标记的兔抗鼠免疫球蛋白孵育。用此方法发现短期滤液中缺乏自溶产物，并发现其由33种主要成份组成。1998年，SonnenbergMG等报道以双相聚丙烯酞胺凝胶电泳由结核分支杆菌培养滤液中发现有205个蛋白斑点，然后用N末端测序、ESI和MS鉴定出了其中的32个蛋白。1998年结核分支杆菌全基因组测序完成后，根据其表达蛋白的序列，可以对38个分泌蛋白的鉴定起到帮助。RonsenkrandI等结合MS技术，从620个蛋白斑点中鉴定出了49个蛋白。相信随着研究的深入，新的分泌蛋白还可能被陆续发现。

2.2　分支杆菌分泌蛋白功能的研究

虽然已知分支杆菌有800多种分泌蛋白，但只鉴定出13个蛋白的主要结构。目前已克隆出24种结合分支杆菌分泌蛋白的基因，但这些基因的分布呈不均一性，这在研制新的诊断试剂及高效结核疫苗方面将起到重要作用。综合评价已经进行研究的基因疫苗免疫效果，其中表现出高度保护性的有，Hsp65，Ag85A，Ag85B，ESAT-6，PstS3和MPB83。这6种基因蛋白表达中，除了MPB83未发现能引起细胞免疫外，其余均可以引起体液免疫和细胞免疫；具有重度保护力的有MPT64，MPT63，Mr39000，Mr38000，KatG和PstS2，也大多既能引起体液免疫也可引起细胞免疫；Hsp70，MPT32，MPT70，MPT83，Mr36000等仅表现出较低的保护力，大多仅能引起单方面的免疫反应；另外还有Ag85C，Mr22000，α，Mr19000，AhpC，HBHA，PstS1等没有表现出保护力。

3　分支杆菌分泌蛋白所致体液免疫反应的特点

在结核病人体液免疫的血清学诊断中，常观察到某个单个适当的抗原血清学诊断从来没有令人满意的表现，接近30%的结核病人为血清学阴性。不同个体之间血清抗体对抗原的识别有差异，此为结核体液免疫的特点，可能与结核不同时期产生不同的分支杆菌抗原等因素有关。在参加试验性牛结核所用的多种抗原中，不同的动物及同一动物疾病不同时期对抗原的识别有差异。牛结核的血清学诊断仅可通过合理设计涵盖广谱特异性抗体的混合抗原来进行。

4　展望

近十年来，人们对分支杆菌培养液中的分泌蛋白进行了广泛的研究，发现分支杆菌生长期分泌的蛋白对结核病的保护性免疫是很重要的，对结核病的预防和诊断具有重要意义。随着新的研究设备出现以及研究技术的不断更新，蛋白质分离分析研究已经提高到一个新水平，同样极大推动了分支杆菌蛋白质组分的分析和研究。分支杆菌基因组测序工作的完成，为进行分支杆菌蛋白质组学研究奠定了基础。开展分支杆菌蛋白质组学研究，可通过高通量的筛选手段发现许多新的蛋白质，研究其生物学功能，为结核分支杆菌致病机制、免疫机制及检测诊断等构建数据库平台。可以预见，通过蛋白质组学研究，许多用于分支杆菌检测以及研制亚单位疫苗的新抗原分子将会被发现。寻找分支杆菌特异性蛋白质组分作为检测靶标分子，利用免疫学和分子生物学等手段，研究先进的结核病诊断方法，研究有效的基因工程亚单位疫苗，有利于从免疫学和分子生物学方面入手探索结核病诊断的新途径，从基因工程亚单位疫苗入手探索结核病免疫的新途径。