摘 要：为建立酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbentassay，ELISA)检测猪血清或尿液中猪表皮生长因子(porcine epidermal growthfactor，pEGF)的含量，以pEGF为包被原，人表皮生长因子(human epidermal growthfactor，hEGF)为竞争抗原，两者与一定量的抗pEGF多抗反应。结果表明，理想的包被抗原浓度为0.625μg/mL，抗pEGF工作浓度为1∶64 000，酶标二抗工作浓度为1∶20 000，可检测的最适范围为0.4 ng/mL～32ng/mL，最低检测限为1ng/mL，批内和批间变异系数分别为3.50%和5.22%。得到回归方程y＝－34.53x＋76.06(R2＝0.993)和标准曲线，从而建立了快速定量测定pEGF含量的酶联免疫吸附试验方法。
关键词：猪表皮生长因子；多克隆抗体；间接竞争ELISA
猪表皮生长因子(porcine epidermal growthfactor，pEGF)是一个含有53个氨基酸残基的单链多肽生长因子，具有广泛的生物活性。本研究采用重组(pEGF)为抗原，抗pEGF为抗体，建立了间接竞争酶联免疫吸附法(ELISA)检测pEGF的标准曲线，并确定了该方法的最低检测限和线性范围，为检测猪体内和发酵液中pEGF提供了方法。
1 材料与方法
1.1 实验动物
新西兰大白兔3只，雌性购自南方医科大实验动物中心。
1.2 仪器及设备
Costar可拆酶标板(美国Coring公司)，EXL800酶标仪(美国BIO-TEK公司)，冷冻离心机(德国Eppendorf公司)。
1.3 试剂
1.3.1 hEGF 0.2 mg/瓶(Invitrogen)；Freund’s completeadjuvant(Sigma)；HRP标记的羊抗兔IgG(Sigma)；邻苯二胺(OPD)(Sigma)；其他试剂均为分析纯。
1.3.2 包被液(0.01 mol/L，pH 9.6，碳酸盐缓冲液) 准确称取NaHCO3 2.93 g，Na2CO3 1.59g，加双蒸水至1 000 mL，置4 ℃保存。
1.3.3 洗涤液(PBST) 250 μL吐温溶于500 mL PBS(0.01 mol/L，pH 7.4)。
1.3.4 封闭液 称取5 g脱脂奶粉溶于100 mL pH 7.4 0.01 mol/L PBS中，现用现配。
1.3.5 抗体稀释液 0.25 g明胶溶于250 mL pH 7.4 0.01 mol/L PBS中，50 ℃加热溶解。
1.3.6 底物缓冲液 1.02 g无水柠檬酸，3.68 g Na2 HPO4·12H2O，加双蒸水至200 mL，调pH为5.0。
1.3.7 显色液 OPD 12 mg溶于30 mL底物缓冲液中，再加24 μL 300 mL/L的H2O2。
1.3.8 终止液 10 mL浓硫酸，加90 mL蒸馏水。
1.4 方法
1.4.1 pEGF多克隆抗体(以下称多抗)的制备 取1 mg pEGF溶解于2.5mL无菌双蒸水中，然后与等量的弗氏完全佐剂充分乳化。采用皮下多点免疫法，每次每只注射1mL抗原，间隔2周后，再用相同剂量的弗氏不完全佐剂乳剂，免疫接种1次，1周后采血。耳缘静脉采血，将血液4 000r/min冷冻离心10 min，取上清，置－20 ℃保存。
1.4.2 间接ELISA 测定3只兔抗血清效价分别为1号兔1∶32 000,2号兔1∶8 000,3号兔1∶64000。选取3号兔血清进行试验。
1.4.3 间接竞争ELISA 参照文献进行。①包被。pEGF用包被缓冲液稀释成0.625 μg/mL，并包被酶标板，每孔100μL，置4 ℃冰箱中过夜。②洗涤。甩掉包被液，PBST洗3次，在吸水纸上拍干。③封闭。每孔加入200 μL封闭液，37 ℃水浴中2h，然后用PBST 洗涤3次。④阻断反应。采用板内阻断模式，在奇数列将一系列浓度32、16、8、4、1、0.4、0.2、0ng/mL，pEGF 50 μL/孔，偶数列加入抗体稀释液，每孔50 μL,1∶64 000倍稀释的pEGF多抗，每孔50 μL，37℃水浴中，竞争反应1 h。⑤加酶标二抗。用PBST洗板3次，加1∶20 000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG，每孔100 μL,37℃孵育1 h。⑥显色反应。PBST洗板3次，加新鲜配制的显色液每孔100 μL，37 ℃，避光温浴10min。⑦终止反应。加终止液每孔50 μL。⑧测定OD490。用EXL800型酶标仪测定各孔490 nm波长的吸光度值。
1.4.4 包被原和一抗最佳工作浓度的确定 参照文献进行。用方阵法确定包被原和一抗最佳工作浓度，分别将抗原作系列稀释，使其终浓度为10、5、2.5、1.25、0.625、0.3μg/mL；血清作1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000、1∶64 000、1∶128000稀释，最后选择OD490值等于1.0左右的稀释倍数作为理想的工作浓度。
1.4.5 理想竞争反应时间和温度的确定 用1.4.4确定的条件做间接竞争ELISA，在竞争反应这一步，将6块板分为2组，每组3块，其中一组置于室温孵育，另一组在37℃水浴中孵育。每组板分别经0.5、1、2 h各取出1块，测定其OD490 值，并计算各自的抑制率，找出理想的竞争反应时间和温度。
1.4.6 标准曲线的制作 将hEGF分别稀释成36、18、9、4、2、1、0.5、0.25、0ng/mL系列浓度，根据以上优化得到的最佳包被抗原浓度、最佳抗体稀释倍数及竞争反应时间和温度，进行间接竞争ELISA测定，制作标准曲线。以各浓度hEGF抑制的OD490值记为B，其中无hEGF抑制时的OD490记为B0。因为B/B0%值与lg(pEGF)成线性回归关系，从而可计算回归曲线的方程及相关系数。
1.4.7 精密度
1.4.7.1 批内误差 每一个标准品浓度设置4个重复，以其批内变异系数表示批内误差。
1.4.7.2 批间误差 重复1.4.6操作，连续3次以其批间系数表示批间误差。
2 结果
2.1 多抗和包被抗原最佳浓度的筛选
方阵滴定结果见表1。
表1 抗pEGF多抗和包被抗原最佳浓度筛选结果
Table 1 Optimal concentration of rabbit anti-pEGF serum and coatedantigen
多抗 Rabbit anti-pEGF serum | 包被原浓度/(μg·mL－1) Concentration of coat antigen | |||||
10 | 5 | 2.5 | 1.25 | 0.625 | 0.3 | |
1∶8 000 | 2.846 | 2.718 | 2.453 | 2.024 | 1.851 | 1.468 |
1∶16 000 | 2.424 | 2.301 | 2.108 | 1.752 | 1.610 | 1.126 |
1∶32 000 | 2.076 | 1.977 | 1.75 | 1.54 | 1.279 | 0.824 |
1∶64 000 | 1.573 | 1.480 | 1.326 | 1.120 | 1.014 | 0.621 |
1∶128 000 | 0.856 | 0.754 | 0.526 | 0.469 | 0.385 | 0.278 |
1∶256 000 | 0.421 | 0.302 | 0.214 | 0.192 | 0.084 | 0.091 |
空白 Blank | 0.031 | 0.054 | 0.047 | 0.027 | 0.035 | 0.049 |
2.2 竞争反应时间对测定结果的影响
结果见表2和表3。
表2 竞争反应时间的选择
Table 2 Selection of optimal competitive time
标准品浓度/(ng·mL－1) Standard hEGF | OD | 抑制率/% Blocking rate | |||||
0.5 h | 1 h | 2 h | 0.5 h | 1 h | 2 h | ||
0 | 1.331 | 1.735 | 1.919 | ||||
9 | 1.182 | 1.260 | 1.665 | 11.2 | 27.4 | 13.2 | |
18 | 1.054 | 0.856 | 1.529 | 20.8 | 50.7 | 20.3 | |
36 | 0.875 | 0.701 | 1.357 | 34.3 | 59.6 | 29.3 | |
72 | 0.705 | 0.556 | 1.168 | 47.0 | 70.0 | 39.1 | |
144 | 0.520 | 0.351 | 0.795 | 60.9 | 79.7 | 58.6 |
表3 竞争反应温度的选择
Table 3 Selection of optimal competitive temperature
标准品浓度/(ng·mL－1) Standard hEGF | OD | 抑制率/% Blocking rate | |||
25 ℃ 1 h | 37 ℃ 1 h | 25 ℃ 1 h | 37 ℃ 1 h | ||
0 | 1.658 | 1.854 | |||
9 | 1.435 | 1.321 | 13.4 | 28.7 | |
72 | 0.873 | 0.732 | 47.2 | 60.5 |
2.3 间接竞争ELISA标准曲线的建立
从表4可知，当hEGF为0.4 ng/mL时，OD490值与0的OD490值有明显的差异，故检测限为0.4 ng/mL。
表4 hEGF间接竞争结果
Table 4 Results of indirect ELISA for hEGF
hEGF/(ng·mL－1) | OD490 | B/B0% |
0 | 1.832 | 100.00 |
0.2 | 1.805 | 98.53 |
0.4 | 1.630 | 88.97 |
1 | 1.451 | 83.35 |
4 | 1.070 | 62.12 |
8 | 0.768 | 34.06 |
16 | 0.608 | 26.58 |
32 | 0.451 | 22.27 |
2.4 精密度
2.4.1 批内变异系数 以标准曲线的批内变异系数(CV)表示。CV%＝SD的均值/平均批内结合率×100%＝2.43/69.5＝3.50%。
2.4.2 批间变异系数 以3块板测定的结合率值进行平均。求出各浓度的板间变异系数，再平均求其板间变异系数(CV),3批测定中，各浓度的板间变异系数在2.01%～11.8%之间，平均为5.22%，从批内和批间误差可以看出，本方法重复性好。
图1 B/B0%-lg(hEGF)曲线
Fig.1 Curve of B/B0%-lg(hEGF)
3 讨论
pEFG相对分子质量为7000，小分子抗原因缺乏可作夹心法的2个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，实验采用竞争法模式。酶联免疫吸附试验由于灵敏度高、特异性强等特点已经在临床上获得了广泛的应用，但ELISA测定中影响因素较多，酶标板的质量对测定结果有很大的影响，现在使用较多的酶标板是聚苯乙烯或者聚乙烯板，不同厂家、不同批次生产的板对试验结果的影响也不尽相同，建议最好使用同一厂家同一批次生产的板，有条件的最好使用进口板。反应体系中采用方阵滴定法确定最佳包被原和一抗的工作浓度时，其中包被原的浓度梯度和一抗的稀释比例一定要合适，包被原的浓度梯度和稀释比例不能过大，这样筛选出来的最佳包被原浓度和最佳一抗工作浓度才比较准确，低浓度的pEGF才能被竞争下来，使OD490下降，否则一抗过饱和则竞争不下来，OD490无明显变化。有文献报道板外竞争比板内竞争结果更准确，但经过两种方法的多次比较发现，板内和板外竞争对结果的影响很小，反而板外竞争出现误差的几率比板内大的多，故试验中仍然选用板内竞争的模式。在试验过程中，单抗和酶标二抗的效价在常温很容易降低，从而影响OD490值，为了使试验结果准确，应避免不必要的波动，单抗和酶标二抗均要求现用现配。另外，一些在4℃存放的缓冲液，在用前30min要取出在常温预热。最后，在整个试验过程中所用的洗涤剂和缓冲液在配制时都要按照要求准确调节pH，这些微小的因素有时也能对整个试验的结果产生不必要的误差。
本试验建立的pEGF间接竞争ELISA标准曲线可应用到实际检测中，用此方法测定猪血液、尿液以及发酵液中pEGF的含量，为后续对pEGF进行更深入的研究提供了定量基础。
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