摘 要：根据GenBank鸡β-actin、IFN-γ的基因序列设计引物，应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术克隆获得β-actin和IFN-γ基因，采用β-actin为内参的半定量方法检测IFN-γmRNA在鸡柔嫩艾美耳球虫免疫前后不同时间的表达情况，以探讨IFN-γ的表达动态与柔嫩艾美耳球虫免疫的关系。结果显示，IFN-γ在两次免疫期间的表达量整体上呈现双峰模式，首免后第7天达到一个高峰，二免后第7天达到另一个高峰。
关键词：盲肠扁桃体；β-肌动蛋白；γ干扰素；逆转录-聚合酶链反应；鸡
干扰素(Interferon，IFN)是多功能细胞因子家族中的一员，它在抗病毒性疾病和恶性肿瘤及增强机体免疫调节能力方面有明显效果。干扰素分为Ⅰ型和Ⅱ型两类，Ⅱ型干扰素包括IFN-α和IFN-β等，IFN-γ又称免疫干扰素。IFN-γ通过增强巨噬细胞的吞噬活性及淋巴细胞对靶细胞的特殊细胞毒性，起到免疫调节作用。球虫感染时，IFN-γ可激活巨噬细胞，增强MHCⅠ、Ⅱ类抗原的表达来调节获得性免疫，提高K细胞和NK细胞的毒性作用，并促进这些细胞产生自由基，以杀伤球虫或宿主细胞，抵抗球虫感染。IFN-γ还可刺激粒细胞的增殖与分化并增强对肿瘤、细菌、病毒和寄生虫的非特异性免疫反应。目前，鸡IFN-γ已作为鸡球虫感染时细胞免疫的测定指标。
本试验选择从柔嫩艾美耳球虫(Eimeriatenella)主要侵害的部位——鸡盲肠扁桃体取材来克隆获得鸡的IFN-γ，然后再采用β-肌动蛋白(β-actin)做内参的半定量RT-PCR方法来检测IFN-γmRNA在鸡球虫病免疫前后不同时间的表达动态，从而来研究E.tenella免疫与IFN-γ的表达动态关系。
1 材料与方法
1.1 试验用动物
1日龄海兰灰蛋鸡，购自北京市昌平种鸡场，未落地前饲养于汽油喷灯火焰消毒的无球虫笼舍中，饲喂无球虫、无抗球虫药的饲料和饮水。
1.2 载体和菌种
pGEM-T克隆载体为Promega公司产品，宿主菌JM109购自北京全式金生物技术有限公司。
1.3 酶和试剂
M-MLV反转录酶、Taq酶、dNTP、Oligo(dT)15为Promega公司产品，Trizol为Invitrogen公司产品，RNasin为宝生物工程(大连)有限公司产品，UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒为上海生工生物工程技术服务有限公司产品。其他试剂均为分析纯。
1.4 主要仪器
核酸浓度测定仪(Biophotometer，德国Eppendorf公司)，梯度PCR仪(PTC-200C，美国Bio-rad公司)，凝胶成像系统(AlphaImagerHP，美国Alpha公司)。
1.5 引物
根据GenBank上鸡β-actin(登录号：L08165)、IFN-γ(登录号：DQ470471)的基因序列设计引物：β-actin上游：5′-CCACAGCTGCCTCTAGCTCT-3′，下游：5′-ACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3′，预期片段大小为384bp，IFN-γ上游：5′-CTTGCCAGACTTACAACT-3′，下游：5′-ACCTTCTTCACGCCATCA-3′，预期片段的大小为337bp，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
1.6 总RNA的提取及序列扩增
1.6.1 总RNA的提取 无菌取鸡盲肠扁桃体，按Trizol说明书的操作方法分离纯化总RNA。用核酸蛋白浓度测定仪检测其浓度，用甲醛变性凝胶电泳确定其完整性。
1.6.2 cDNA合成 RT反应体系为25 μL：总RNA模板2 μg，Oligo(dT)151 μL (0.5 μg/μL)，加灭菌超纯水构成9 μL反应体系，置70 ℃反应5 min，立即冰浴，然后再加dNTPs 1.25μL (10 mmol/L)，RNasin 0.5 μL (40 U/μL)，M-MLV 5×buffer 5 μL，M-MLV 1μL (200 U/μL)，最后用灭菌超纯水补至25 μL，置37 ℃反应1.5 h。
1.6.3 PCR反应 反应体系为50 μL：cDNA 1 μL，5×buffer 10 μL,50 pmol/L上下游引物各1μL，5 U/μLTaqDNA聚合酶0.25μL，加灭菌超纯水至50 μL。β-actin PCR扩增条件为：首先95 ℃预变性3 min；然后94 ℃ 30s,61.9 ℃30 s,72 ℃ 30 s，共35个循环，最后72 ℃ 5 min,4℃结束反应。IFN-γ的PCR扩增条件为：首先95℃预变性3 min；然后94 ℃ 30 s,52.3 ℃ 30 s,72 ℃ 30s，共35个循环；最后72 ℃延伸5 min,4 ℃结束反应。
1.7 鸡β-actin与IFN-γ的克隆鉴定与测序
按DNA回收试剂盒说明书操作，用15 g/L的琼脂糖凝胶对RT-PCR产物进行电泳纯化，将其与pGEM-T载体4℃过夜连接，转化大肠埃希菌感受态细胞JM109。
随机挑取LB平板上生长良好的白色单菌落，分别接种到含Amp的LB液体培养基上，37℃摇菌过夜。取菌液做模板PCR鉴定。将PCR鉴定的菌液吸取1 mL进行测序，剩余的菌液保存于－80 ℃冰箱中。
1.8 半定量RT-PCR检测IFN-γ在鸡球虫病免疫期间的表达动态
1.8.1 材料的获得 无菌饲养1日龄雏鸡，随机分成试验组和对照组，试验组共48只鸡，分别在12日龄和22日龄时用活卵囊进行2次免疫，免疫剂量为每只鸡500个卵囊，对照组鸡给以等量生理盐水。对照组共90只鸡，分别在1、5、7、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、38、39日龄时每次取6只鸡的盲肠扁桃体。试验组于13、19、21、25、27、29、31、39日龄时每次取6只鸡盲肠扁桃体，取材后保存于液氮中。
1.8.2 半定量RT-PCR 分离纯化每组不同时间采集的盲肠扁桃体的总RNA，随机选取一总RNA作为模板，以不同循环数分别扩增<,SPAN>β-actin与IFN-γ，电泳检测确定各自扩增的最佳循环数，然后以最佳循环数扩增获得不同时间的β-actin与IFN-γ。扩增产物电泳后于凝胶成像系统进行定量分析，以IFN-γ/β-actin的净灰度比表示免疫不同时间IFN-γ的相对表达量。本试验重复4次，统计数据并绘制图表。
2 结果
2.1 RT-PCR结果
对盲肠扁桃体所提取的RNA进行浓度测定及完整性检测后，以质量合格的总RNA为模板进行RT-PCR扩增，电泳结果显示，得到了与预期结果相符的约384bp的β-actin和337 bp的IFN-γ特异性片段(图1和图2)。
1.DNA标准DL 2 000；2.β-actin
1.DNA Marker DL 2 000；2.β-actin
图1 β-actin PCR扩增电泳图
Fig.1 Electrophoresis of β-actin PCR products
1.DNA标准DL 2 000；2.IFN-γ
1.DNA Marker DL 2 000；2.IFN-γ
图2 IFN-γPCR扩增电泳图
Fig.2 Electrophoresis of IFN-γPCR product
2.2 克隆与鉴定
β-actin和IFN-γ的PCR产物经纯化并连接到pGEM-T载体后，转化大肠埃希菌JM109，摇菌后PCR鉴定获得了相应大小的片段。
2.3 鸡β-actin与IFN-γ基因核苷酸序列的测定
对所构建的pGEM-T-chβ-actin和pGEM-T-chIFN-γ质粒进行测序，比对结果显示，β-actin与目的序列(GenBank登录号L08165)的一致性达99.2%，IFN-γ与目的序列(GenBank登录号DQ470471)的一致性达99.4%，说明是所要扩增的目的基因。将扩增到的鸡IFN-γ基因与几种哺乳动物的IFN-γ基因序列也进行了比对，比对结果显示同源性较低。
2.4 IFN-γ在鸡球虫病免疫期间的表达动态
2.4.1 β-actin与IFN-γ PCR扩增时最低循环数的确定如图3和图4。
1.16；2.18；3.19；4.20；5.23；6.DAN Marker DL 2 000
图3 β-actin不同循环数的电泳图
Fig.3 β-actin electrophoresis indifferent cycles
1.23；2.27；3.30；4.31；5.32；6.34；7.空白；8.DNA标准DL 2 000
1.23；2.27；3.30；4.31；5.32；6.34；7.Blank；8.DNA Marker DL 2 000
图4 IFN-γ不同循环数的电泳图
Fig.4 IFN-γ electrophoresis in different cycles
根据上面的电泳照片，统计结果后得出其不同循环数的曲线图(图5)。
图5 β-actin与IFN-γ不同循环数PCR产物电泳图
Fig.5 The electrophoretis analysic of PCR products of β-actin andIFN-γ in different cycles
根据图5确定了β-actin PCR扩增时的最低循环数为19个循环，IFN-γ PCR扩增时的最低循环数为31个循环。
2.4.2 IFN-γ与β-actin不同时间PCR产物的凝胶电泳结果见图6和图7。
1～15.对照组1、5、7、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、38、39日龄；16.DNA标准DL 2000；17～24.试验组13、19、21、25、27、29、31、39日龄
1-15.1,5,7,11,13,15,17,19，21,23，25,27，29,38,39 days old chicken ofcontrol groups；16.DNA Marker DL 2 000；17-24.13,19,21,25,27,29,31,39days old chicken in experimental groups
图6 不同日龄IFN-γ鸡PCR产物的电泳图
Fig.6 Electrophoresis ofIFN-γ PCR products indifferent age chickens
1～15.对照组1、5、7、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、38、39日龄，16.DNA标准DL 2000,17～24.试验组13、19、21、25、27、29、31、39日龄
1-15.1,5,7,11,13,15,17,19,21,23,25,27,29，38,39 days old chicken i,n<, /SPAN>control groups；16.DNA Marker DL 2000；17-24.13,19,21,25,27,29,31,39 days old chicken in experimentalgroups
图7 不同日龄β-actin鸡PCR产物的电泳图
Fig.7 Electrophoresis of β-actinPCR products indifferentagechickens
2.4.3 IFN-γ在鸡球虫病免疫前后不同时间的表达动态 经过4次重复，求取平均值，绘制的IFN-γ在鸡球虫病免疫前后不同时间的表达动态(图8)。
图8 IFN-γ在鸡球虫病免疫前后不同时间的表达动态
Fig.8 The kinetic expression of IFN-γ before and after immunization
由图8可以看出，在一免后的第1天和第7天是显著升高(P<0.05)，在二免后的第7天极显著升高(P<0.01)，二免后第5天显著降低(P<0.05)。一免后的第7天和二免后的第7天分别是两次免疫的最高峰值。
3 讨论
干扰素是一类重要的淋巴细胞因子，在机体抗感染免疫中具有重要的作用。国内外医学研究者对人类和啮齿动物干扰素都已经进行了大量的研究。到目前为止，人们在人、哺乳动物、鸟类、鱼类、龟类和贝类动物体内都发现了干扰素，干扰素具有一定的种属特异性，在同种细胞上具有广谱抗病毒、抗细胞分裂及免疫识别等多种生物学功能。干扰素最早发现于禽类，但禽类干扰素的研究尤其是分子生物学水平的研究一直相对滞后，直到1994年Sekellick M J等才将鸡的Ⅰ型干扰素基因克隆成功，DigbyM R等在1995年成功克隆到了鸡IFN-γ基因。近几年来，随着分子生物学技术的飞速发展，禽类干扰素在基因和蛋白水平的研究也越来越多。国内也有很多学者相继研究了IFN-γ的克隆以及重组IFN-γ在球虫感染中的作用。本试验总结前人扩增IFN-γ的经验，对鸡IFN-γ进行了克隆测序，并用软件对其进行了序列比对，比对结果显示与预期片段的大小相符，与其他物种IFN-γ的同源性较低，表明本试验成功克隆获得了海兰灰鸡的IFN-γ。
鸡IFN-γ是由抗原或有丝分裂原刺激T细胞而产生的高活性细胞因子，具有十分重要的免疫调节功能，目前有人已证实IFN-γ基因具有一定的佐剂效应。叶秀华等在2004年就通过试验证明IFN-γ能够使感染球虫的鸡卵囊排出量减少，相对增重率增加。基于这一研究，又进一步将重组鸡IFN-γ与E.tenella活卵囊同时免疫鸡只，结果证明重组鸡IFN-γ能够增强鸡体抗球虫的细胞免疫作用。在鸡球虫的保护性免疫中，IFN-γ可以抑制E.tenella子孢子的侵入和发育，但IFN-γ本身对子孢子并无毒害作用。它主要是激活感染艾美耳球虫动物的巨噬细胞和其他一些细胞，促进这些细胞产生自由基，以杀伤球虫或宿主细胞，从而使鸡体抵抗球虫感染。本试验主要研究IFN-γ在鸡球虫病免疫前后的表达动态，探讨IFN-γ在球虫感染免疫期间不同时间的作用效果。
通过试验得出，IFN-γ在两次免疫过程中其表达动态总体上呈双峰模式，首次免疫后的第1天IFN-γ表达量就开始增加，到第7天表达量达到最高，随后开始降低。二次免疫后在第5天之前表达量一直低于正常值，在第7天表达量达到最高，从第9天表达量又开始降低，到二次免疫后第17天时表达量又回到了正常值。这与YunC H等在E.tenella感染后检测到鸡的IFN-γ mRNA在第6天和第8天时明显增多基本吻合。IFN-γ的分泌主要是由CD4＋T细胞分泌的，在球虫的内生性发育过程中免疫细胞不断受到球虫抗原刺激从而使IFN-γ的产生逐渐增多。此外，IFN-γ的产生还受多种因素的影响，如球虫的抗原性，鸡的免疫状态以及鸡的遗传因素等。Martin A等用不同的球虫抗原刺激鸡体，结果发现它们激起IFN-γ产生的效果是不同的。Choi K D等早在1999年就研究了两种近交系SC鸡和TK鸡在堆形艾美耳球虫感染后IFN-γ在局部的表达情况，发现初次感染后SC鸡盲肠扁桃体IFN-γ的表达维持相对恒定而TK鸡却表现为显著减少。二次感染后，两种鸡盲肠扁桃体IFN-γ的表达量均随时间而增长，因此他们提出了堆形艾美耳球虫感染后，淋巴细胞亚群和细胞因子mRNA的表达受鸡的免疫遗传因素所控制的观点。由此推测出本试验中IFNγ在E.tenella免疫期间也存在着免疫遗传差异，从而导致了免疫期间有些阶段的表达量会低于正常值。
综上所述，IFN-γ在鸡球虫免疫期间不同时间的表达量是不同的，一般在免疫后的第7天时表达量较高，而此时也正是机体所受球虫损伤最严重的时候，说明IFN-γ的表达量与机体所受的损伤程度变化是一致的。但同时由于还存在着鸡品种的差异，可能会对表达动态有一定的影响。因此，在IFN-γ已被证明在球虫免疫过程中起着重要作用，可以作为免疫佐剂使用的基础上，把握其有规律的表达曲线来指导用药会更有利于提高治疗效果。本研究已对其进行了初步的探讨，但要最终确立一个准确的表达动态曲线还有待于进一步的研究，特别是免疫遗传因素影响的研究。
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