摘 要：从黑龙江省绥化市某养鸡场疑似鸡传染性支气管炎的鸡群中采集病料，经鸡胚传代、电镜观察、生物学特性和分子生物学鉴定以及动物回归试验，表明该分离株具有明显的鸡传染性支气管炎病毒特征，具有鸡胚出现卷曲、出血、发育延迟等作用；对新城疫病毒有明显的干扰作用；动物回归试验导致未免疫鸡出现明显的感染症状，剖检可见明显的肾脏肿胀、尿酸盐沉积现象，同时可见呼吸道有出血现象。对该毒株的N基因进行扩增，并将其序列与NCBI的参考毒株的N基因进行序列对比，发现其与国内的分离株SC和N毒株的N基因具有较高的同源性，为97.6%；与国外参考毒株和国内的疫苗株同源性较低，为84.8%。表明分离的病毒为鸡传染性支气管炎病毒。
关键词：鸡传染性支气管炎病毒；分离；鉴定；N基因
鸡传染性支气管炎(Infectious bronchitis，IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(Infectiousbronchitisvirus，IBV)引起鸡的一种急性、高度接触性传染病，该病主要导致鸡的呼吸道、输卵管、肾脏、肠道、肌肉及腺胃等多种组织器官的病变。各种日龄的鸡都可以感染IBV，常常导致产蛋鸡出现蛋产量和品质下降的现象，该病是影响世界各国养禽业发展的重要传染性疾病之一。我国邝荣禄于1972年首次在广东发现该病，以后在全国范围内陆续发生不同致病型的IB。2006年3月在黑龙江省绥化市某养鸡场已经免疫过的蛋鸡群中发生了疑似IB的传染病。病鸡剖检主要表现为气管环状出血，肾脏肿大且有尿酸盐沉着呈花斑肾状，输尿管扩张，内有尿酸盐沉积，盲肠出血，肝脏出血。本研究对病死鸡的肾脏材料进行了病毒分离，对该病毒进行了系列试验，最终确定该病毒为IBV，命名为SH株。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病料 2006年3月，从黑龙江省绥化市某鸡场疑似传染性支气管炎的发病鸡群内，无菌采集病死鸡的肾脏。
1.1.2 鸡胚和雏鸡 SPF鸡胚，9日龄，购自黑龙江生物制品一厂；非免疫雏鸡15只，购自哈尔滨市呼兰区胜利孵化厂。
1.1.3 新城疫病毒La Sota株 由黑龙江省兽医卫生防疫站提供。
1.1.4 工具酶、载体、受体菌及主要试剂 参照GenBank中的IBVN基因设计引物，引物序列：P1：ACAAATAATAATAACTTGCTATC，P2：TTACAACTCATTCTCTCCAAGT，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；RNA提取试剂盒、Ex TaqDNA聚合酶、DNA Marker DL 2000、pMD18-T载体、dNTP及鼠源反转录酶均购自联星生物制品公司；受体菌选用DH5α，本研究室保存。其他试剂均为分析纯。
1.2 方法
1.2.1 病料处理 无菌采取肾脏组织，剪碎，加入灭菌生理盐水研磨，制成1∶5的悬液，反复冻融3次，3 000 r/min离心15min，取上清液，加入适量双抗后4 ℃作用过夜，再用微型滤器(0.45 μm滤膜)过滤除菌备用。
1.2.2 鸡胚接种 参照文献，取上述处理后的上清液尿囊腔接种9日龄 SPF鸡胚6枚，0.2mL/枚，同时设立不接种的对照组，置于37 ℃温箱中孵育。并照蛋检查鸡胚发育情况，弃掉24 h内的死胚。收集24 h～72h死亡的鸡胚置于4 ℃冰箱中24 h后，收集尿囊液并观察鸡胚病变状况。同时再进行盲传2代，每代次均选用6枚鸡胚，并设立对照组。
1.2.3 病毒的鉴定
1.2.3.1 血凝特性试验 参照文献，尿囊液经10 g/L的胰酶处理后，采用β微量法进行HA试验。
1.2.3.2 对新城疫病毒的干扰作用 将HA阳性的6份尿囊液稀释后接种 SPF鸡胚，37 ℃孵育16 h后再接种NDV LaSota株，同时设立只注射NDV的对照组，37 ℃孵育48 h后收集尿囊液测定血凝价。
1.2.3.3 电镜形态观察 样品由哈尔滨师范大学生物系电镜室观察
1.2.4 动物回归试验 取第3代尿囊液滴鼻非免疫鸡10只， 0.2mL/只，观察鸡群变化，记录鸡群发病数、发病症状及病死鸡的剖检状况。同时设立未接种对照组。
1.2.5 病毒N基因的克隆与序列比较 参照文献，选用第3代尿囊液，采用RT-PCR方法进行扩增，并与GenBank中的IBV参考毒株进行序列比较。各参考毒株的序列登陆号分别为：SC：EU200779；H120：AY028296；H52：AF352310；Gray：S48137；D41：AY846837；N4/03：DQ059623；SH：DQ472166；Beaudette：AJ311362；N：AF352309。
2 结果
2.1 感染鸡胚的病变特征
病料接种后，第1代72h内有4枚鸡胚死亡，其余2枚活动减少。剖检可以见到病死的鸡胚全身出血，肾脏肿大，心肌有出血点；羊膜增厚，尿囊液增多，同时胚体发育受阻，明显小于对照组的正常鸡胚，出现胚体卷缩，双脚抱头现象。第2代和第3代全部在72h内死亡，病理变化与第1代剖检变化相同。
2.2 病毒鉴定
2.2.1 血凝特性 各代次尿囊液用10 g/L胰酶处理后，进行血凝试验，结果显示血凝价随着传代次数的增加而升高。结果见表1。
表1 各代次病毒胰酶处理后血凝价
Table 1 HA titers of isolated viruses treated with trypsin
编号 Number | 血凝价/log2 HA titer | ||
第1代 1st generation | 第2代 2st generation | 第3代 3st generation | |
1 | 2 | 4 | 6 |
2 | 1 | 3 | 6 |
3 | 3 | 5 | 8 |
4 | 3 | 6 | 8 |
5 | 2 | 5 | 7 |
6 | 3 | 6 | 8 |
表2 NDV经IBV分离株干扰后的血凝价
Table 2 HA titer of NDV inhibited with the isolated strain of IBV
样品 Sample | 血凝价/log2 HA titer | |||||
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
IBV＋NDV | 5 | 5 | 3 | 4 | 3 | 5 |
NDV | 8 | 8 | 9 | 8 | 9 | 9 |
2.3 动物回归试验
攻毒后第2天，部分鸡出现精神沉郁，咳嗽症状，同时伴有水样便。第4天开始出现死亡鸡只，但是也有部分鸡逐渐恢复正常。剖检病死鸡可以看到气管黏膜出血，肾脏病变明显，肿胀，输尿管中有白色尿酸盐沉积。
2.4 N基因的克隆
按照常规方法进行RT-PCR操作，扩增产物进行8 g/L的琼脂糖凝胶电泳，可见有1.3 kb大小的片段，结果如图1所示。
2.5 N基因的同源性分析
系统进化树分析显示，SH与SC和N参考毒株在同一群内，与二者的同源性为97.6%，与疫苗株H120、H52以及其他国内外参考毒株组成的另一大群的同源性稍低，为84.8%。SH与其他参考毒株的N基因序列比较如图2所示。
1.RT-PCR产物；M.DNA标准DL 2 000
1.RT-PCR product； M.DNA Marker DL 2 000
图1 IBV分离株N基因的RT-PCR结果
Fig.1 RT-PCR results of N gene from the isolated strain
图2 SH/03/2006与参考毒株N基因的系统进化树
Fig.2 Phylogenetic tree constructed on the N gene of SH/03/2006 andreference strains
3 讨论
IB作为影响全世界养鸡业的重大疫病之一，在临床上主要以预防为主，疫苗的使用是防控该病的首选。目前，在黑龙江省主要应用H120或者H52疫苗株进行免疫，但是在已经免疫过的鸡群中却又频繁的发生IB，给养殖业主带来严重的经济损失。因此，选用与流行毒株血清型相同的疫苗株，对于更好的预防该病的发生具有重要的意义。因为IBV具有变异频率高，血清型多的特点。所以，分离鉴定新的变异毒株，对于制备新的疫苗具有重要的意义。本研究分离的SH为地方分离毒株，是在已经应用疫苗的情况下又出现的IBV的感染，该毒株的分离对于研究已免疫鸡群发生IB后IBV的新变异特征具有基础研究价值。
作为冠状病毒的代表毒株，IBV的主要结构蛋白可以分为S、N、M和E4种蛋白，其中N蛋白具有保守程度高、变异较小的特征，因此本研究选用N基因进行克隆、扩增，以便从分子水平上鉴定该毒株为传染性支气管炎病毒分离株。序列分析表明，该毒株与国内分离株SC和N参考毒株核苷酸具有较高的同源性，可以达到97.6%，与国内常用疫苗株和其他国内外参考毒株的同源性稍低，为84.8%，因此，可以证实该毒株为IBV。同时，SPF鸡胚试验、血凝特性试验和动物回归试验也进一步证实该病毒具有典型的IBV特征。该毒株与国内致肾脏病变性SC和N毒株的高同源性，也预示着该毒株可能也为致肾脏病变型毒株，但是具体确定该毒株的组织嗜性还需要进行一系列的病理方面的详细研究，并对该毒株的主要免疫原S蛋白进行进一步的研究，以最终确定该毒株的变异规律。
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