摘 要：根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲型标准株(ATCCVR-2332)的ORF7保守序列和猪圆环病毒2型(PCV-2)(AF381175)的ORF2基因保守序列，设计合成了两对特异性引物。用这两对引物，通过优化的PCR条件，对PRRSV阳性毒株反转录后的cDNA模板和PCV-2毒株的DNA模板进行双重PCR扩增，同时得到两条与试验设计相符的432bp(PRRSV)和630bp(PCV-2)特异性条带，建立了同时检测PRRSV和PCV-2的双重PCR方法。并用此方法对在安徽省不同地区所采集的72头份病猪的淋巴结、肺、肝、脾、肾等组织进行检测，证明建立的PCR方法可用于临床诊断。
关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒；猪圆环病毒2型；双重PCR；应用
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndromevirus，PRRSV)引起的一种接触性传染病，俗称“蓝耳病”，患病母猪的繁殖障碍(流产、死产、弱仔)和仔猪的呼吸道症状(高热、呼吸困难)是该病的临床特点。猪圆环病毒2型(Porcinecircovirus，PCV-2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemic wastingsyndrome，PMWS)的重要病原。两种病毒的感染都严重损害免疫器官，造成免疫抑制，导致其他传染病的继发。因此，PRRSV和PCV-2的感染现均已成为严重影响我国养猪业发展的重要传染性疾病。
由于在临床上PRRSV和PCV-2的混合感染现象较为普遍，而且这两种病毒引起的临床表现也非常相似，因此早期鉴别诊断并及时了解流行状况对控制这两种病的流行显得尤其重要。常规的诊断方法是病原分离鉴定和血清学方法，但这些方法存在敏感性低、特异性差、操作费时费力等局限性。所以建立一种针对PRRSV和PCV-2的快速、特异、敏感的分子生物学检测方法具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 参考毒株 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)由农业部青岛动物检疫所提供；猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪细小病毒(Porcine parvoviruses， PPV)、猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)、猪瘟病毒(CSFV)均由安徽省兽医工作站提供。
1.1.2 主要试剂 dNTP、DNA Marker DL 2000、TaqDNA聚合酶购自上海生工生物工程技术服务有限公司，5×RTbuffer及M-MLV酶和RNA酶抑制剂购自宝生物工程(大连)有限公司。
1.1.3 引物的设计 根据PRRSV美洲型标准株(ATCCVR-2332)的ORF7保守序列和PCV-2(AF381175)的ORF2基因保守序列，设计了扩增片段分别为432bp和630 bp的两对特异引物，引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
PRRSV：P1,5′-ATGGCCAGCCAGTCAATCA-3′，P2,5′-TCGCCCTAATTGAATAGGTG-3′。
PCV-2：P1,5′-GGTTACACGGATATTGTAGTCC-3′，P2,5′-CGTTACCGCAGAAGAAGACAC-3′。
取1g左右所采集的病料组织充分研磨制成悬浮溶液，反复冻融3次，离心取上清，然后分别按RNA提取Trizol试剂盒和UNIQ-10柱动物基因组DNA抽提试剂盒进行抽提。
1.2.2 PRRSV的RT-PCR和PCV-2的PCR扩增 PRRSV RT-PCR反应条件为：70 ℃ 10 min，42 ℃ 1h；94 ℃ 5 min后进入PCR循环；95 ℃ 5 min， 94 ℃ 50 s,54 ℃ 1 min,72 ℃ 1min,35个循环；72 ℃ 10 min。
PCV-2 PCR反应条件为：95 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，53 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,30个循环；72℃ 10 min。
1.2.3 PCR产物的分析 取6 μL PCR产物直接经10 g/L琼脂凝胶(含0.5μg/mL溴化乙锭)电泳，凝胶成像仪上观察、拍照。
1.2.4 双重PCR检测PRRSV和PCV-2最佳反应条件的确定 将PRRSV的cDNA和PCV-2的基因组DNA混合作为双重PCR的模板，在不同引物比例、Mg2＋浓度及退火温度条件下进行PCR反应，以确定最佳PCR反应条件。
1.2.5 双重PCR检测PRRSV和PCV-2的特异性 根据最佳PCR反应条件，同时对PRRSV、PPV、PRV、CSFV和PCV-2进行检测。
1.2.6 双重PCR检测PRRSV和PCV-2的敏感性 利用分光光度计测定PRRSV反转录的cDNA和PCV-2的DNA含量，然后用双蒸水将其作10倍递增稀释，分别取原液及其各稀释度液作为模板进行PCR扩增，电泳后观察条带的亮度，直至不出现目的条带。
1.2.7 对临床病料的检测应用 应用建立的双重PCR方法，对2006年10月～2007年11月份来自安徽省不同地区的72份疑似病料(采集每头猪的肝、脾、肺、肾及肠系膜淋巴结)进行检测。
2 结果
2.1 双重PCR检测PRRSV和PCV-2的最佳反应条件
反应体系总体积为25 μL，其中10×buffer 2.5 μL，25 mmol/L MgCl2 2 μL，dNTP 2.5mmol/L 2 μL，PRRSV上、下游引物(25 pmol/μL)各0.5 μL和PCV-2上、下游引物(25pmol/μL)各1.0 μL， PRRSV的反转录产物模板2 μL和PCV-2的DNA模板3 μL，Taq酶 0.3μL，灭菌双蒸水10.2 μL。反应程序为95 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，54 ℃ 1 min,72 ℃ 1min,30个循环；72 ℃ 10 min。
2.2 双重PCR检测PRRSV和PCV-2的特异性
对PRRSV、PCV-2及其两种混合病毒均扩增出相应的特异性片段，与预期长度一致，而对PPV、PRV和CSFV则均未扩增出任何条带，见图1。
M.DNA标准DL 2000；1.PCV-2毒株；2.PRRSV；3.PCV-2和PRRSV混合毒株；4.PPV；5.PRV；6.CSFV
M.DNA Marker DL 2 000；1.PCV-2；2.PRRSV；3.Mixing of PCV-2 andPRRSV；4.PPV；5.PRV；6.CSFV
图1 PCR特异性检测结果
Fig.1 Results of specific product detection by PCR
2.3 双重PCR检测PRRSV和PCV-2的敏感性
将浓度为4.8 ng～4.8 ng×10－8(PRRSV的cDNA)、5.0 ng～5.0ng×10－8(PCV-2的DNA)进行PCR扩增，电泳结果显示，两对引物能出现清晰条带的最低浓度分别为4.8 ng×10－4和5.0ng×10－4(图2)。
1-9.4.8 ng～4.8 ng×10－8 PRRSV， 5.0 ng～5.0 ng×10－8PCV-2； M.DNA MarkerDL 2 000
图2 PCR的敏感性检测结果
Fig.2 Result of sensitivity detection by PCR
2.4 临床病料PRRSV和PCV-2双重PCR检测
应用试验所建立的双重PCR方法，对采集的72份临床病料进行检测，其中有40份PRRSV检测阳性，阳性率为55.56%(图3)；11份PCV-2检测阳性，阳性率为15.03%(图4)；其中8份PRRSV和PCV-2同时检测阳性，阳性率为11.11%(图5)。
M.DNA标准DL 2 000；1～6.6份感染病料；7.阳性对照；8.阴性对照
M.DNA Marker DL 2 000；1-6.6 infected samples；7.Positivecontrol；8.Negative control
图3 6份感染PRRSV病料的PCR检测结果
Fig.3 The detective results of 6 samples infected with PRRSV by PCR
M.DNA标准DL 2 000；1～6.6份感染病料；7.阳性对照；8.阴性对照
M.DNA Marker DL 2 000；1-6.6 infected samples；7.Positivecontrol；8.Negative control
图4 6份感染PCV-2病料的PCR检测结果
Fig.4 The detective results of 6 samples infected with PCV-2 by PCR
M.DNA标准DL 2 000；1～6.6份混合感染病料；7.阳性对照；8.阴性对照
M.DNA Marker DL 2 000；1-6.6 Co-infected samples；7.Positivecontrol；8：Negative control
图5 6份混合感染PRRSV和PCV-2病料的PCR检测结果
Fig.5 The detective results of 6 samples co-infected with PRRSV andPCV-2 by PCR
3 讨论
多重PCR是标准PCR的发展和完善，是指同时应用多对引物扩增微生物核酸的不同片段。它的优点包括快速、简便及消耗较少的试剂等。当动物机体同时感染多种病原微生物时，用多重PCR检测是方便可行的，而且多重PCR更优于普通的PCR，因为它能同时区别出不同类型的微生物。因此，多重PCR成为具有早期诊断、病原学分类鉴定、流行病学调查分析、传染源追踪于一体的检测方法，且省时、省力、灵敏度高、特异性强，鉴于这些优点，本试验建立了PRRSV和PCV-2的双重PCR检测方法。
本研究建立的PRRSV和PCV-2的双重PCR检测方法，不仅特异性强，而且具有较高的敏感性，使原本需3 d以上的检测时间缩短为1d，从而为PRRSV和PCV-2感染的调查研究提供了简便、快速、准确的检测方法，显示其重要的实际应用价值。试验中我们体会到，建立多重PCR的关键是试验条件的优化，即不仅要考虑引物设计和反应条件(注意引物二聚体的形成和所扩增片段的保守性；注意各对引物比例、模板间的比例及退火温度，反应条件要有利于片段较小的一方等)，同时还要注意各对引物扩增片段的大小，以便在琼脂糖凝胶电泳中能够明确区分开，本试验所扩增的两个片段分别为432bp和630 bp，便于结果观察。
最后，利用所建立的PRRSV和PCV-2双重PCR方法，对72份临床病料进行检测，结果表明了该方法的实际应用效果较好，值得推广。同时，也表明目前PRRSV在安徽省猪群中的感染情况非常严重；虽然相比之下，PCV-2的阳性检出率较低，与国内相关报道有一定差异，但本实验室曾在2006年，对安徽省部分猪场中PCV-2的感染情况进行调查的结果显示，PCV-2的平均感染率为36.67%。在72份检测病料中，只有8份为PRRSV与PCV-2混合感染，虽然检测率较相关报道的低，但由于PRRSV、PCV-2在猪群中感染的普遍，因此两者混合感染潜在的上升趋势依然存在。此外，从发病的猪龄来看，断奶仔猪和育肥猪是PRRSV与PCV-2混合感染的易发阶段，与王天户等所报道的结果一致。
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