p53基因与肿瘤形成

摘　要：肿瘤抑制基因的研究已经成为继癌基因之后肿瘤遗传学、分子生物学领域的前沿和热点，尤其是抑癌基因p53越来越被人们重视。研究表明正常的p53，又称野生型p53，在细胞损伤后的修复过程中发挥重要作用。正常p53的功能像“分子警察”一样监视着基因组DNA的完整性。在细胞发生DNA损伤时，p53蛋白能使细胞分裂终止在G1/S期，以使细胞有足够的时间修复损伤，恢复正常状态。若不能修复，野生型p53还能启动细胞的凋亡过程从而引发细胞的程序性死亡，阻止具有癌变倾向的突变细胞产生。而突变型p53基因会导致肿瘤的发生，大多数肿瘤与p53的突变有关。文章着重阐述了p53的表达与突变、p53的稳定调节及p53的转录调控等。

关键词：p53；抑癌基因；肿瘤

p53被称为“基因组卫士”，最早于1979年发现，只是最初曾认为p53基因是一种有显性转化作用的核内癌基因。直到1988年，才提出p53基因是一种肿瘤抑制基因。

p53基因相继在人类、猴、鸡和鼠等动物中发现，人类p53基因定位于17p13，全长约20kb，由11个外显子和10个内含子组成，转录成2.5 kb mRNA，编码393个氨基酸的蛋白质，分子质量为53ku。该蛋白是一种核结合蛋白，含有3个主要功能区：①N末端转录激活区，可激活转录，介导蛋白间相互作用，这一区域还可与p53的负调控因子结合；②中央DNA核心结合区，这一区域具有特异性结合DNA的功能，并且是肿瘤细胞突变热点区域；③C末端非专一DNA结合区，包括核定位信号区(nuclearlocalization signal，NLS)和核输出信号区(nuclear export signal，NES)。

1　p53的表达与突变

1.1　p53的表达

p53是应激性蛋白，在正常情况下，p53以野生型形式存在，维持较低水平，在细胞中不发挥作用，只有在细胞受到刺激后，引起细胞核内p53水平的升高，p53才开始发挥其细胞周期阻滞、细胞凋亡、维持基因组稳定等转录因子的功能。一般把激活p53的信号分为三类：①基因毒应激引起的p53活化。由紫外线、X射线、γ射线、致癌物、细胞毒及一些药物等所引起DNA损伤，导致各种蛋白激酶被激活，如毛细血管扩张性共济失调突变基因(ataxia-telangiectasiamutated gene，ATM)和毛细血管扩张性共济失调相关基因(ataxia telangiectasia relatedgene，ATR)，促使p53在特异的丝氨酸残基发生磷酸化，影响p53与鼠双微基因2(mice doubleminigene，MDM2)的产物MDM2相互作用。②癌基因激活引起p53的活化。如Ras、Myc癌基因等能够诱导可变阅读框基因(alterativereadingframe，ARF)所表达的蛋白增加，通过ARF与MDM2的结合，下调MDM2蛋白，引起p53水平升高。③非基因毒应激引起的p53活化。如应激、缺氧及核苷酸耗竭等信号，激活各种应激激酶，促使p53在苏氨酸81位残基发生磷酸化，增强了p53的稳定性。

1.2　p53的突变

在肿瘤发生过程中，p53丧失了保护基因组完整性的功能，主要是因为p53突变导致了其DNA结合核心区域单链残基改变所致。研究发现，p53的突变主要是错义突变，常常发生在特定编码区，如175,245,248,249,273和282，也就是常说的突变热点区，这些位点对p53蛋白的癌抑制功能非常重要。因此，这些位点发生突变，导致p53的DNA结合区域单链残基改变，而失去转录下游因子发挥肿瘤抑制功能，从而导致肿瘤的发生。

在大多数人类肿瘤中，p53突变的发生率超过半数，而随着p53研究的深入，发现禽白血病、牛白血病及犬的结肠直肠癌、乳腺瘤等动物的肿瘤疾病也有p53的突变。虽然p53的突变导致肿瘤的发生，但研究发现突变的p53在体外能够结合DNA，保持野生型构象，而在体内没有转录活性。

2　p53的稳定调节

2.1　p53与MDM2相互作用

MDM2是p53的转录靶基因，含有两个p53基因结合位点，在抑制p53的活性过程中发挥关键的作用。研究发现，在胚胎发育过程中，缺乏MDM2而使p53激活会导致胚胎死亡，而MDM2的过表达会导致p53的失活。

p53的过表达或活性上升可激活MDM2基因的启动子，从而促进MDM2表达，致使细胞中MDM2蛋白水平升高，并转而与p53的N末端转录激活区结合形成复合物，封闭其转录活性，抑制其功能，而MDM2水平的升高，反过来激活p53，抑制MDM2，这样就形成了一个p53/MDM2负反馈调节环，调节p53的稳定性。

另外，在没有各种应激刺激的条件下，MDM2通过泛素蛋白连接酶，使p53羧基末端多个赖氨酸泛素化，促使p53的降解。研究显示，p300拥有内源E3活性，且能识别MDM2介导的p53泛素化，而后发挥E4活性，与MDM2共同参与p53的降解。同时，MDM2蛋白还可结合p53，通过本身结构的核定位与核输出信号，不停地穿梭于细胞核与细胞质之间，将p53运出细胞核，进入细胞质，而p53只有位于胞质才能被降解。AKT作为一种丝氨酸/苏氨酸激酶，在166位丝氨酸和186位丝氨酸磷酸化MDM2，促使MDM2从细胞质向细胞核转运，介导p53降解失活。

由基因毒损伤激活的激酶，包括ATM和ATR，降低了p53降解能力，并使p53稳定。其他应激反应诱导的检查点激酶1(checkpointkinase 1，Chk1)和检查点激酶2(checkpoint kinase2，Chk2)，可磷酸化p53，从而削弱了MDM2与p53的结合，从而提高其稳定性。例如，c-Jun氨基端激酶受到UV照射后将p53分子81位苏氨酸残基磷酸化，而Polo样激酶3在活性氧作用下将p53分子20位丝氨酸磷酸化。

2.2　p53其他方式的稳定调节

Huang J等发现了一种新的smyd酶，可以使p53蛋白编码3705的特异赖氨酸甲基化，导致p53蛋白不能与DNA结合而发挥作用，从而能在机体不再需要p53蛋白发挥作用时抑制p53蛋白的活性。TakagiM等研究中发现两种互相竞争的蛋白，核糖体蛋白和核仁蛋白，通过它们的相互竞争可以对p53的mRNA进行调控。p53基因5′端的非翻译区域就是与这两个蛋白相结合的区域。在健康细胞中，核仁蛋白与mRNA的5′非翻译区域结合，p53蛋白的合成被抑制。但是在DNA受损后，核糖体蛋白结合到5′非翻译区域结合，使mRNA翻译出更多的p53蛋白，而不象过去认为的那样，在DNA受损后，p53在细胞内水平上升是仅仅由于p53蛋白在细胞内降低被降解率来完成的。

3　p53转录调控系统

在DNA损伤信号传递给p53后，p53激活其下游相关基因以修复DAN的损伤。同时，p53的下游基因在p53基因转录调节作用下，检测到DNA损伤后使细胞周期停滞，为修复DNA损伤争取时间，如果损伤太大以至无法完成修复，由p53介导凋亡相关基因诱导细胞程序性死亡。其中，p53在细胞周期阻滞和细胞凋亡过程中发挥了重要作用。

3.1　p53与细胞周期阻滞

细胞周期过程中涉及许多重要事件，其中包括不可逆的形式，启动细胞的生物化学活性，以一种状态进入另一种状态，称为细胞周期转换，而常常是在细胞周期转换时接受和传递活性或抑制信号。细胞对DNA损伤作用的反应是激活细胞周期的检查点。至少有两个检查点在细胞周期转换过程中发挥重要作用。G1期检查点，决定G1/S期转换，阻止受损DNA进行复制；G2期检查点，决定G2/M期转换，阻止损伤的或不完全复制的DNA进入有丝分裂。而不同的蛋白激酶修饰p53不同的DNA结合位点，诱导激活不同的p53靶基因，导致细胞停顿于不同的周期位点。

3.1.1　p53诱导G1期的阻滞　p53通过调节其下游效应基因，如周期蛋白依赖性激酶相互作用蛋白-1基因(CDK-interactingproten 1，Cip1)， 野生型p53激活片段1基因(Wild-type p53-activated fragment1，Waf1)， 以及生长阻滞和DNA诱导损伤基因45(growth arest and DNA damage-inductiongene 45，GADD45)等在DNA损伤所致的G1/S停顿中起重要作用。CIP/WAF1表达的产物为p21蛋白，发现组蛋白乙酰化酶抑制剂可使p53的羧基末端373/382位点的赖氨酸发生乙酰化，并且证明该特异位点的乙酰化导致p53下游重要的靶基因p21激活，进而启动一系列生物学效应，如引起G1期阻滞，而p21的表达是引起G1期阻滞的直接原因。p21与多种细胞周期蛋白-细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-cyclindependentkinases，cyclin-CDK)结合形成三聚体，抑制G1期cyclin-CDK复合体的激酶活性，阻止了细胞从G1期进入S期，导致G1期阻滞。同时，当DNA损伤，p53转录激活GADD45，该基因可与PCNA(增殖细胞抗原)结合，从而抑制DNA的合成，阻止细胞进入S期。

3.1.2　p53诱导G2期的阻滞　在p53调控的G2进入M期转换机制中，p53对细胞分裂周期基因2(cell divisioncycle，cdc2)和细胞周期蛋白B1(cyclinB1)的抑制使G2期发生阻滞。cdc2对于进入有丝分裂是必不可少的，cdc2与cyclinB1的结合或通过CAK的磷酸化均能使cdc2激活。cdc2同时被p53的3个转录靶分子p21、14-3-3δ、Gadd45抑制。p21控制细胞分裂的开关，能直接抑制cdc2,14-3-3δ与cdc2在细胞质中结合，阻止其诱导有丝分裂；Gadd45使cdc2与cyclinB1分离，而cdc2的激活需要结合cyclin B1。另外，p53还可通过转录激活B99基因的表达，引起G2期阻滞。

3.2　p53与细胞凋亡

当DNA损伤无法修复时，p53除了阻滞细胞周期调控外，另一重要的作用的是促进细胞凋亡。p53介导细胞凋亡主要通过两个方面：一方面，p53通过转录激活其他前凋亡基因介导细胞凋亡，如Puma、Noxa、p53AIP1、Bax、Apaf-1等。另一方面，p53在Bcl-家族作用下通过对线粒体调控来介导细胞凋亡。野生型p53下调B细胞淋巴瘤2(B-celllymphoma，Bcl-2)，上调Bax，使Bcl-2/BAX比值下降，降低线粒体的跨膜电位，同时，激活的p53直接或间接调节一些蛋白的表达，来控制线粒体膜的通透性，促使细胞色素C释放和胞质中ATP的释放，两者一道结合Apaf1后，激活半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶9(caspase-9)，被激活的半胱氨酸-天冬氨酸蛋白9(caspase-9)裂解下游的蛋白酶半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)，引起细胞凋亡。

另外，p53也能促使氧化应急相关基因表达，表达的产物产生活性氧(ROX)导致线粒体释放细胞色素C及凋亡起始因子，激活Caspase-3，引起细胞凋亡。同时，研究者发现了一种与p53有关的基因-Bnip3L，认为p53最初抑制肿瘤的方式之一就是开启Bnip3L，而激活的Bnip3L也能导致细胞的凋亡。

4　p53基因家族

近年来，随着对p53基因的深入研究，p53家族的其他成员也不断被发现(表1)，包括p73和p63。它们与p53功能非常相似，都能激活p53相关靶基因，引起细胞周期停滞及细胞凋亡。KarenH等研究表明突变的p53能够通过其DNA结合核心区与p63和p73相互作用，下调它们的功能。而在结构上，它们具有与p53同源的DNA结合域。

p73基因于1997年是在COS细胞cDNA文库中偶然发现的，定位于人染色体1p36.2-1p36.3。p73基因与p53基因有高度的同源性，在N-端转录激活区、核心DNA结合区、C-端寡聚体化区，p73与p53分别有29%、63%、38%的同源性。p73由13个外显子和12个内含子组成，至少有6个亚型，不同亚型编码的剪切异构体表现出不同甚至相反的生物学功能，如TAP73参与细胞凋亡和细胞周期，而△NP73与肿瘤生成有关。

1998年，几个研究小组先后发现了第3个p53家族成员，分别命名为Ket、p53、p40、p63和p73L，经过随后的研究证实，它们都属于p63的异构体，而有的学者习惯称为p51。

p63基因定位于人3号染色体3q27～3q28，全长包含有15个外显子和两个不同的启动子，p63基因至少编码14种异构体。相对于p53而言，p63与p73基因序列具有更高的相似性。p63在N-端转录激活区、核心DNA结合区、C-端寡聚体化区这3个主要功能域上与p53分别有22%,60%,35%的同源性。相比之下p63除了这3个功能域以外还包括一段较长的N-末端，其N末端区内含有一个SAM区(sterileaipha motif)。在人类肿瘤中很少发生p63突变。Mills AA通过对动物模型鼠及人p63的研究分析，探讨p63是癌基因还是抑癌基因，但并没有给出明确的答案。

表1　p53家族成员基本特征比较

Table 1　Comparison of basic characteristics among the p53 familymember

Note：①“＋” means activator；②“－” means inhibitor；③“？”means unknown；④“SAM” means sterile motif； ⑤“NLS” means nuclear localizationsignal.

5　鸡的p53基因

鸡的p53基因由Thierry S等从SPF鸡脾细胞cDNA文库中克隆并测序了p53cDNA编码区，全长1 500bp，有完整的编码区、5′、3′非编码区和多腺苷酸信号区，编码367个氨基酸，与人的p53有47%的同源性。

国外学者研究发现，从来源于MD和AL的淋巴样肿瘤细胞系中检测的p53突变情况时发现，在p53转录激活突变热点区域并没有突变的发生，并指出p53基因的突变和p53转录删除可能是由MD病毒诱导的而改变分子之一，同时也指出p53开放阅读框的截顶可能是p53改变剪接引起的。TakaglM等在研究相同的肿瘤细胞系时指出，短型p53在化学疗法的复合物和放线菌素D诱导细胞早期凋亡过程中发挥重要作用。Christman1S等研究表明，p53与p21WAF1基因的改变有利于sc-2鸡成纤维细胞无限增殖。而国内学者研究禽白血病时也证实，突变p53基因参与了蛋鸡J亚群禽白血病的发生、发展过程，另外低浓度镉引起的细胞凋亡与p53mRNA表达密切相关，高浓度的镉能导致鸡脾脏淋巴细胞坏死。李奎等发现在正常生理情况下，细胞凋亡基因p53参与了固始鸡中枢免疫器官内淋巴细胞发育分化过程中的凋亡调控，对免疫器官的稳定发挥重要作用。

6　展望

由于p53具有“分子警察”的功能，可引起细胞周期阻滞、诱导细胞凋亡，为癌症的治疗提供希望，与此同时它可调控干细胞的增生来替代已损伤细胞，将为肿瘤治疗中避免机体的衰老过程提供理论依据。