狂犬病实验室诊断研究进展

摘　要：狂犬病是世界上最可怕的人兽共患传染病，所有温血动物对狂犬病均易感，狂犬病已成为世界严重的公共卫生问题。暴露后疫苗接种可以达到有效的预防，狂犬病的预防和暴露后处理措施的有效实施均有赖于实验室的安全、准确、快速诊断。另外，免疫后及时对血清中和抗体效价进行监测，也是防控狂犬病的关键措施。文章从狂犬病实验室诊断的安全问题、实验室检测样本的选择、组织学检查、病毒抗原检测、生物学鉴定、核酸检测及血清抗体检测等方面对狂犬病实验室诊断方法及研究进展等进行综述和评价。

关键词：狂犬病；实验室诊断；抗原；核酸；血清学

狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(Rabiesvirus，RV)引起的高度致死性传染病。全世界每年约有5.5万人死于狂犬病，其中90%以上发生在亚洲和非洲。我国是世界上受狂犬病危害最为严重的国家之一，每年狂犬病发病和死亡人数位于印度之后，居世界第2位。近几年我国人狂犬病发病数和死亡数呈持续上升趋势，居我国法定报告传染病发病总数和死亡总数之第二位，病死率和死亡率则位居各法定报告传染病首位。每年约有1000万～1200万人接受狂犬病暴露后疫苗接种。特别是2006年和2007年，我国人的狂犬病发病数和死亡数自1990年以来首次突破了3000例，正在形成第3次流行高峰，形势十分严峻。因此，必须加强对狂犬病的诊断监控力度。在狂犬病实验室检测方面，荧光抗体试验(fluorescentantibody test，FAT)是狂犬病最重要的诊断方法，狂犬病组织培养感染试验(rabies tissue-cultureinoculation test，RTCIT)、小鼠接种试验(mouse inoculationtest，MIT)为确诊的辅助方法。用于病毒抗原检测的其他方法，如狂犬病快速酶联免疫吸附试验(rapid enzyme-linkedimmunosorbent assay，R-ELISA)，检测病毒核酸的原位杂交(in situhybridization，ISH)、反转录-聚合酶链反应(reverse transcription polymerasechain reaction，RT-PCR)和荧光定量-聚合酶链反应(quantitative-polymerase chainreaction，Q-PCR)等也都日渐用于狂犬病的诊断，后者结合核苷酸序列遗传进化分析而用于分子流行病学调查及基因型确定。在血清抗体检测方面，世界卫生组织(WHO)和世界动物卫生组织(OIE) 推荐的方法有快速荧光灶抑制试验(rapid fluorescent focus inhibitiontest， RFFIT)、荧光抗体病毒中和试验(fluorescent antibody virus neutralizationtest， FAVNT)、ELISA、小鼠病毒中和试验(mouse virus neutralization test，MVNT)等。

1　狂犬病实验室诊断的安全问题

任何有关狂犬病的实验室工作都具有高危险性，所有RV可疑污染的物品都应该按照WHO的要求在安全的条件下妥善处理。所有进行狂犬病诊断以及进行尸体剖检的工作人员在工作之前，都应进行疫苗免疫接种并确认获得保护。接触狂犬病的专业人员，如接触患病动物的兽医、可能接触狂犬病病例的医务人员，以及与狂犬病患者密切接触的人，都应该接受暴露后处理措施(postexposuretreatment， PET)。

2　实验室检测样本的选择与评价

2.1　脑

狂犬病是一种以侵害中枢神经系统为特征的致死性疾病，通常采用脑组织学和病毒学检查来确诊。对于病死的动物和人，脑是病毒学检测的主要样本。RV在大脑尤其在海马回、阿蒙氏角及脑干内大量存在，在大脑皮层、小脑、脑的其他部位及蛛网膜也有病毒存在。脑组织一般是在开颅后取出，需要专业Ⅱ级以上技术人员，并具有安全设备。也可不采用开颅的方法通过枕骨富尔曼孔或眶后途径得到阿蒙氏角和脑干。BinghamJ等用FAT方法重新检测了252例狂犬病患者的阳性脑组织样本，结果显示检测样本还应该包括脑干，因为丘脑，脑桥，髓质都是病毒抗原大量存在的组织。丘脑也可以检测到病毒包涵体。此外，病人的皮肤、角膜及脑脊液等非脑样本也是必须考虑的。

2.2　皮肤

由于脑的活检不太可行，因此皮肤活检更为实用，是临床阶段人狂犬病有效的早期诊断方法。Blenden DC报道，在野外对被咬伤动物进行样本采集和实验室检查评价，皮肤也是非常好的样本。该方法在60%～100%的病例中获得了阳性检测结果，并且在几乎所有狂犬病晚期阶段病人的皮肤样本中都能检测出病毒，但早期样本病毒检出率较低。皮肤活检最好的部位是颈部，有时在其他部位上皮也能检测出病毒。皮肤活检比角膜压印片具有更好的重复性。使用FAT和免疫组化及各种免疫酶技术等都能从皮肤样本中检测出病毒抗原，并且应用免疫荧光技术对皮肤活检具有很高的灵敏性。

2.3　角膜

由于在终末期狂犬病患者角膜上发现了RV,1969年Schneider LG等首次把角膜作为生前诊断材料用于实验小鼠狂犬病检测，后又用于人类狂犬病的生前诊断，即在病人的角膜压片(不是抹片)中检测病毒抗原。这种压片是通过接触角膜中间部分的微型载玻片制成，经固定或置于－20℃保存以便于抗原的检测。Zaidman G W报道，在狂犬病急性脑炎患者的角膜压片中检出了病毒。

2.4　唾液和唾液腺

在感染后期，RV沿中枢神经系统下行，通过传出神经扩散到机体的各组织和器官，病毒不仅在所有神经细胞中复制，同样也在唾液腺细胞内进行再复制，新生的病毒贮存在唾液管内并随唾液释放。感染动物在出现临床症状的前几天，唾液中就已含有了RV。因此，唾液和唾液腺是细胞培养和实验动物接种等方法进行病毒分离的重要样本。唾液还是RT-PCR方法确诊狂犬病的尚佳样本。

2.5　脑脊液

狂犬病患病动物及病人的脑脊液是重要的检测样本，因为脑脊液含有病毒抗原和循环抗体。病毒可通过脑脊液在中枢神经系统内扩散，已证实在感染后期人和狗脑脊液中含有中和抗体。

2.6　其他组织

检测狂犬病毒的主要样本是中枢神经系统组织、唾液腺、皮肤、角膜等，但有报道表明狂犬病毒也存在于其他分泌物中，以及带毒动物的扁桃体，死者和病死动物的其他器官。

LiZ等对墨西哥和中国的14例狂犬病患者的样本材料调查研究显示，病毒存在于许多器官组织(包括胃肠道和心脏、舌、喉的肌肉纤维)的神经丛中。有时也能在舌部及唾液腺、肾上腺髓质检测出RV，偶尔也会在上皮细胞、味蕾处检出。通过蝙蝠进行RV和狂犬病相关病毒(Rabies-relatedvirus， RRV)流行病调查时，也需要一些非脑、非唾液腺的样本。

3　组织学检查

RV引起的脑炎特征是广泛的神经原侵害，但仅局限于细胞损伤，肉眼观察只有一定程度的脑水肿。1903年AdlochiNegri在RV感染组织细胞浆内发现了嗜酸性包涵体——Negri’sbody(内基氏小体)，从此将检测内基氏小体作为狂犬病的确诊方法。内基氏小体是典型的圆形或椭圆形带有碱性颗粒的嗜酸性物质。检测样本包括海马回、脑干、小脑等，进行一般病理组织切片制作或新鲜样品涂片。当组织学检查发现有狂犬病特征性病变时，检查内基氏小体，能达到简便、快速地确诊，但内基氏小体的检出率只有50%～80%。与其他方法相比，此法需要的抗原量少，能提供更为准确的结果。

4　狂犬病病毒抗原检测

4.1　荧光抗体试验

目前，内基氏小体检测法渐渐地被直接或间接FAT所取代。FAT于1958年首次被使用，并在20世纪70年代成为一种常规的狂犬病诊断方法，也是当今WHO专家委员会推荐的狂犬病诊断方法。在大多数实验室里，直接FAT在检测新鲜或冻存的脑组织切片、角膜压片，以及皮肤活检时作为狂犬病诊断的主要手段。FAT广泛应用于RV抗原检测，与组织学内基氏小体检测相比具有更高的敏感性，对于新鲜样品尤其敏感，但也能用于经胰蛋白酶或其他酶类处理后固定的组织的检测。然而，FAT与MIT相比，敏感性和特异性都略低。应用单克隆抗体在一定程度上提高了FAT的特异性，并且能与RRV相区别。XuGL等用抗核蛋白单克隆抗体制备的荧光抗体，采用间接FAT检测了巴斯德研究所保存的包括基因1型～7型在内的62份狂犬病脑组织样品，并与该所的检测结果相比较，特异性和敏感性均为100%。FAT的优点是能在2h内得到检测结果，但此试验需要荧光显微镜，异硫氰酸荧光素标记的抗RV抗体，以及具有良好素养的专业技术人员。

4.2　免疫组织化学

应用各种类型的免疫组织化学方法，在福尔马林固定的病理标本切片上进行RV抗原检测，用以进行RV致病机制研究及人和动物狂犬病的诊断研究。研究表明，以过氧化酶标记抗体来检测RV抗原比检测内基氏小体更加敏感，其敏感性和FAT相当。LastR D报道，使用亲和素-生物素复合物(avidin-biotin complex，ABC)和过氧化物酶-抗氧化物酶(peroxidase-antiperoxidase， PAP)结合操作，可迅速增强酶促反应。免疫酶技术相对简单，对材料的处理风险较小，并可用福尔马林固定的标本作为检测材料等优点。由于操作时间较长，试剂和仪器相对较贵，而且有些试剂具有毒性或致癌性，因此这些技术并没有被广泛应用。

4.3　酶联免疫吸附试验

ELISA最初用于免疫后动物和人血清中抗RV抗体效价的测定，后经改进用来检测脑组织内的抗原。这就是用于检测感染动物脑组织狂犬病毒核衣壳的快速ELISA(R-ELISA)方法。该法是先将抗RV核衣壳IgG包被在微孔内，以捕获病毒抗原，而后加入过氧化物酶标记的相同抗体来证明特异性RV抗原的存在。R-ELISA和FAT在检测RV抗原方面的敏感性和特异性的比较研究表明，两种方法的相关性达到96%甚至更高，相比之下前者敏感性则要低一些。但对于不适宜用FAT检测的腐败样本，应用R-ELISA则具有更好的敏感性，而且该方法不需要荧光显微镜。据报道一种改良的R-ELISA增加了对RV和RRV的检测效率，这就是用RV核蛋白多克隆抗体为捕获剂建立的R-ELISA方法并结合针对血清1型(PV株)、血清3型(Mokola株)以及欧洲蝙蝠RV 1型(EBL1)的多克隆抗体建立的R-ELISA捕获系统，从而拓宽了检测范围。ServatA等建立的定量间接ELISA试剂盒Platelia Ⅱ来检测免疫动物抗糖蛋白抗体水平，以0.5EU/mL为判定终点，并与FAVN相比较。检测结果显示，特异性在98%以上。对于狐狸的敏感性为92.4%～94.5%，家养食肉动物敏感性为83%。对于犬和猫假阴性率为8.9%～11.1%，假阳性率为1%～2%。

4.4　乳胶凝集试验

Kasempimolporn S等报道，乳胶凝集试验(latex agglutination test，LAT)能在患病犬的脑和唾液中检出RV抗原。方法是从高免马血清中提取抗RV IgG包被乳胶颗粒，来检测病毒。Madhusudana SN等报道，通过对犬的已知阳性和阴性脑和唾液样品中病毒抗原的检测，比较LAT和FAT的检测结果，前者敏感性高达95.2%，特异性高达98.7%，阳性符合率为97.6%，阴性符合率为97.4%。经改良后这种方法也能用于中和抗体的检测和滴定，方法是使用狂犬病毒糖蛋白包被乳胶微球来捕获动物和人血清中的抗体，该方法具有很高的特异性(100%)和敏感性(95.4%)。

5　生物学诊断方法

在狂犬病流行的地区，被犬/猫咬伤者PET的实施，取决于攻击动物脑和唾液等病料中病毒的检测结果。一般将脑组织切片检查内基氏小体和FAT检测特异性抗原作为诊断的第一步，但有些病例的确诊需要通过生物学的方法进行病毒分离，以印证病料中有无病毒的存在。当人暴露于疑似狂犬病动物，且组织检测和FAT检测结果可疑或阴性时，必须通过病毒分离加以确诊。用于病毒分离的病料包括脑组织和唾液腺(通常是颌下腺)。

5.1　实验动物接种

1935年，Webster LT等就建立了乳鼠脑内接种试验(SucklingMIT)并用作狂犬病的确诊和狂犬病疫苗免疫保护试验。后来在MIT基础上，建立了小鼠病毒中和试验(MVNT)，用于疫苗接种动物和人的抗体检测。根据WTO狂犬病专家委员会的建议，人暴露后，所有通过FAT检测阴性的脑样品必须通过MIT进一步确诊。有些实验室已经用细胞培养的方法代替了MIT，但在许多发展中国家，MIT仍然是狂犬病确诊的主要手段。

5.2　细胞培养分离狂犬病毒

细胞培养方法可用于病毒的分离鉴定和狂犬病的确诊，病料选择脑组织和唾液腺，对人和动物的生前诊断可选择唾液、皮肤、脑脊液。但是，从活的动物取样进行病毒检测，得到阴性结果时不能作为最终的结论。皮肤活检有时检查不到病毒。当唾液和脑脊液病毒分离呈阳性时，只有一小部分的动物脑组织检测结果呈阳性。现在很多实验室已经将RTCIT作为狂犬病诊断的一种常规试验方法取代了MIT，因为RTCIT费用较低，较为敏感，容易操作，大大缩短检测时间，即从MIT的30d缩短到RTCIT 的4d。在RTCIT与MIT、FAT几项比较研究表明，在人和动物组织中RV检测方面，RTCIT至少和MIT一样敏感，而其他几种方法都没有MIT敏感。

6　核酸检测

6.1　反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)

当待检样品腐败时，不适于组织学和FAT检测。FAT用在检测RRV病时敏感性较低，并且FAT也不适于液体样本的检测，如唾液、脑脊液等。对RV全基因组的成功克隆和测序，不仅为RV或RRV的分离和鉴定，而且为应用核酸探针以及针对一个或多个基因区域的特异性引物设计来进行RV分子和分子流行病学特征的研究，奠定了良好的基础。应用RT-PCR技术从不适宜组织学检测或病毒分离的腐败样品中建立诊断方法已经成为现实。还可通过针对每一个基因型设计特异性引物或对RT-PCR产物限制性长度的片段的多态现象的分析，或通过核酸测序和对共同基因的遗传进化分析等，利用RT-PCR技术来鉴别RV和不同的RRV。

通过RT-PCR的方法，不仅能从感染个体的脑组织，而且还能从唾液、脑脊液、皮肤及其他组织中扩增出RV特异性核酸序列或从口腔拭子中检测病毒核酸。RT-PCR方法能够缩短检测时间，几个小时之内建立诊断，但目前该方法还只局限在少数实验室进行。由于N基因在RV属中最保守，因此常用于RT-PCR特异性引物设计的靶基因，另外，L基因的某些区域同样很保守，也可用于特异性引物设计的靶基因。据报道该技术对狂犬病患者的生前的诊断尤其适用，因为此时其他方法或者不适用或不敏感。当其他方法不适宜应用时，PCR方法可于狂犬病患者的确诊。几项研究结果表明，RT-PCR与抗原检测和病毒分离的标准方法，如FAT、RTCIT等，相比较检测效果一样好。RT-PCR与以PCR方法为基础的ELISA(PCR-basedELISA，PCR-ELISA)方法结合，近来被用来区别古典RV(基因1型)与RRV欧洲蝙蝠RV(European batLyssaviruses，EBL)。Smith等使用伴有自动测序半套式RT-PCR方法，通过对在出现临床症状36h之内送交的狂犬病人的唾液和皮肤样品中，证实了古典型RV的存在，但是用FAT、MIT、RTCIT检测同样的样品和脑脊液都未检测出病毒。2006年，Vazquez-MorohS等建立了用于检测所有7个基因型的RT-PCR方法。BiswalM等应用套式RT-PCR方法对保存5年～6年的6份阳性和8份阴性非固定的脑组织样本进行了回顾性检测，结果特异性为100%，并且与对照样品无交叉反应。

近年来荧光定量PCR(Q-PCR)技术的不断发展，已成为RNA型病毒研究的重要手段。对于RV，细胞培养系统中活毒的滴定、实验小鼠体内疫苗效价的测定、病毒致病机理研究以及病毒在实验动物体内的分布和载量分析等，Q-PCR将成为病毒定量分析不可替代的方法。Wakeley PR等建立了用于RV基因1、5、6型鉴别的实时定量RT-PCR (real-time RT-PCR)。

6.2　原位杂交法(ISH)

ISH可检测RV抗原和特异性RNA。用于病毒检测的单链RNA探针，其靶基因是编码一个或五个全部的病毒结构蛋白的基因组RNA或mRNA。NadinS A等研制了基因型特异性探针(genotype-specificprobes)，用于福尔马林固定的感染组织中RV的基因分型。Carnieli JP等用RT-PCR方法扩增的PV株N基因cDNA为探针来检测病毒核蛋白基因，检测结果与RT-PCR方法的相关性为100%。FinneganCJ等研制了用于RV和欧洲蝙蝠1、2型病毒检测的RNA探针(riboprobes)。其优点是不仅可以检测病毒基因组RNA，还可检测mRNA以确定病毒是否复制。PraveenaP E等将ISH与PCR方法结合，建立了原位多聚酶链反应(in-situ polymerase chainreaction，ISPCR)，根据RVN基因的保守区域核苷酸序列，制备了用地高辛(digoxigenin)标记的双链核酸探针，与神经组织细胞和神经纤维中的病毒核酸杂交，当在神经原内和神经纤维上出现兰色斑点时即为阳性信号，本方法特异性和敏感性均较高。

7　血清学试验

对于狂犬病的诊断，在疾病的临床症状期血清和脑脊液中出现抗RV特异性抗体是一个很有意义的指征。但仅凭借抗体的检测，用于诊断不仅敏感性低，而且也不可靠。血清学调查表明，只有当病人存活1周以上时，其血清样品中才能检测到抗体，此时结合皮肤生检和唾液检查，血清学检查才有意义。因此，在疾病的早期阶段，用FAT进行皮肤生检，用RT-PCR检测唾液样品，一周后，进行血清样本的RV特异性抗体检测。

早期用于检测和滴定抗体的方法是MVNT，现已被不用实验鼠的方法所取代，如RFFIT、FAVNT及各种改良的ELISA方法。RFFIT是由WHO狂犬病专家委员会建立和推荐的方法，FAVNT是OIE认定的方法。CliquetF将ELISA检测方法标准化，用来测定疫苗免疫动物体中抗RV抗体，结果显示，对于免疫动物抗体的检测，它是一种很好的评价方法，尽管该方法能够进行自动操作，但它的敏感性比RFFIT及FAVNT都要低。GaoMH等用基因工程表达的RV核蛋白建立了检测狂犬病血清抗体的间接ELISA方法。但实施RFFIT和FAVNT等需要具备操作活病毒的实验设备，高度安全的防范设施以及熟练的专业技术人员，而ELISA方法则不需要。

PeharpreD研制出一种用于监测免疫宿主抗RV抗体滴度的快速有效新方法，通过计算机自动荧光检测系统检测荧光信号，有效减少RFFIT和FAVNT工作所需要的时间，并且应用流式细胞仪来估测RV中和抗体的滴度，该方法能得到与RFFIT及FAVN相似的结果。

8　其他检测方法

Vengatesan D等用抗核蛋白荧光抗体媒染感染RV PV株的小鼠神经瘤细胞(MNA)，接毒后24、48、72h，用流式细胞仪来检测感染细胞的比例；血清样本先用RFFIT测定抗体效价，然后用来中和50FFD50PV株，检测未被中和病毒感染MNA的比例。试验结果表明，感染细胞的比例由24 h的26.45%上升到48h的75.28%，抗体效价检测结果与RFFIT的相关系数为0.74。流式细胞法可用于感染细胞抗原的检测和血清抗体效价的测定。KangB等应用狂犬病胶体金免疫层析快速检测(RIDT)试剂盒，通过对51份临床样本和4株分离的病毒进行检测，与FAT相比较，结果显示，敏感性为91.7%，特异性为100%(95.8% CI)。该试剂盒可在野外用于脑组织和唾液等临床样本RV的快速检测。

9　结语

人和动物感染狂犬病毒的诊断常建立在RV抗原的检测和病毒分离上。脑组织材料是病毒抗原检测和病毒分离的最可靠来源，但对于人狂犬病生前诊断，角膜压片、皮肤活检及唾液检查也是重要的检测手段。在大多数实验室，FAT是首要的检查方法，而RTCIT和MIT可作为确诊的倍份措施。然而其他检测抗原的方法如R-ELISA以及检测病毒RNA的RT-PCR等越来越得到广泛应用。以PCR为基础的检测方法在检测腐败病料中病毒RNA有很多优点，而且还能区别古典狂犬病和蝙蝠相关狂犬病毒病。虽然这些方法的使用还局限在少数实验室，但RT-PCR有望取代FAT而成为首要的狂犬病诊断方法，可将诊断时间缩短到几个小时，如结合对RT-PCR产物序列的遗传进化分析，又能从蝙蝠相关狂犬病毒病中区分出古典狂犬病。未来的挑战是在狂犬病较为严重的发展中国家研制简单、特异、敏感，适合于野外和实验室操作的病毒抗原检测、血清抗体监测及病毒核酸检测方法。